虾青素是自然界中一种具有较强抗氧化能力的类胡萝卜素,其中的3S-3’S构型生物学活性最高,在医药品、食品、饲料以及化妆品等生产领域具有广泛的应用价值。为了提高虾青素的生产效率,降低生产成本,本文以酿酒酵母为操作平台,以蛋白质分子改造和动态代谢调控为手段,开展一系列合成生物学方面的应用基础研究,构建产虾青素的酿酒酵母细胞工厂,实现虾青素的高效生物合成。首先,从雨生红球藻中克隆了 β-胡萝卜素酮化酶和β-胡萝卜素羟化酶基因,并通过密码子优化提高了其表达量。将这两个基因整合到产β-胡萝卜素酿酒酵母工程菌中,成功合成了 3S-3’S构型的虾青素。在明确这两个酶的底物选择性后,进一步对这两个酶进行了拷贝数的精细调控,最终通过整合各两个或三个拷贝的OBKT和OCrtZ,获得YPP9和YPP13菌株,虾青素含量分别达到3.54 mg/g DCW和 4.20 mg/g DCW。为了进一步提高虾青素产量,代谢前体物的充足供应和高效转化是必要条件。为此,首先用红发夫酵母牻牛儿基牛儿基焦磷酸(GGPP)合酶的阳性突变体CrtE03M替换出发菌株YPP0中的野生型CrtE,构建的Ycarot-02菌株中前体物质β-胡萝卜素的产量提高56%,达到了 16.37mg/gDCW。其次,通过类胡萝卜素之间的颜色差异,建立了 OBKT的定向进化策略,获得了一株OBKTM阳性突变体,促进了 β-胡萝卜素向下游产物的转化,与表达野生型OBKT的对照菌株相比,β-胡萝卜素的转化率提高了 50%,同时角黄素的产量提高了 1.4倍。结合OBKTM、CrtE03M和途径中其它关键酶基因的过表达,以及辅因子Fe2+的添加,使构建的双倍体菌株YastD-03的虾青素含量达到8.10 mg/g DCW(47.18 mg/L)。在此过程中发现,OCrtZ的酶活也是制约虾青素产量的一个关键因素,因此进一步对OCrtZ和OBKTM进行了共定向进化,获得了 OCrtZM1和OBKTM29突变体,在Ycarot-02菌株中同时表达这两个阳性突变体后,构建的YPP-27菌株虾青素含量达到了 5.70 mg/gDCW,相比于OCrtZ和ObktM组合表达时提高了 38.7%。虽然YPP-27产量低于之前构建的双倍体YastD-03,但由于代谢压力相对较小,菌株的遗传稳定性更好。在对构建的产虾青素酿酒酵母菌株进行发酵研究的过程中,发现类胡萝卜素过早积累会对细胞生长造成不利影响,最终影响高密度发酵。为了解决人工合成途径和底盘细胞之间的相互干扰,在接下来的研究中基于GAL调控系统,开发了一套温度响应的动态调控系统,使细胞生长和产物积累分成两个阶段进行。在敲除GAL80基因的基础上,GAL启动子的活性只受转录激活因子Ga14的控制。基于以上原理,首先利用番茄红素作为指示来建立高通量筛选方法,筛选出了一株温度敏感并且在目标温度保留较高调控活性的突变体Gal4M9,通过温度优化发现在24℃时,Ga14M9的活性最佳。然后,利用报告基因EGFP的表达情况以及番茄红素合成途径中基因的转录水平,对基于Ga14M9构建的温敏型调控系统进行了表征,确认了其温度响应特性。随后,利用番茄红素作为试验产品,构建了温度调控的Ylyc-TS03(+)菌株,在高密度发酵实验中,成功实现了细胞生长和产物合成阶段的分离,并且番茄红素产量达到了 1.14g/L。最后,将该温敏调控系统进一步应用到了虾青素的生物合成中,构建了温敏型菌株Yast-TS9,在摇瓶发酵中表现出明显的温度响应,温度从30℃切换至24℃后虾青素产量提高了 28倍,含量为4mg/gDCW。在补料发酵中,OD600达到了 250左右,实现了高密度发酵,类胡萝卜素的积累也呈现了严谨的温度调控模式,最后总类胡萝卜产量达到 505 mg/L。本研究结合基因挖掘、表达优化、蛋白质工程、动态代谢调控等手段,成功构建了产虾青素酿酒酵母工程菌株。这项工作有效地将理论研究和应用研究进行结合,将为虾青素的生物合成提供技术支持,同时研究过程中开发的蛋白质改造和代谢调控策略将为利用酿酒酵母合成其他高附加值化合物提供方法借鉴。