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随着放射疗法在肿瘤等疾病治疗中使用率的日益提高,放疗所引起的并发症也越来越受到公众的关注。其中,如何预防及治疗辐射性皮肤损伤仍是一个亟待解决的重大问题,目前其治疗尚缺乏有效治疗手段。电离辐射的机制是机体受到照射时产生大量的活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS),而锰超氧化物歧化酶(Manganese superoxide dismutase,MnSOD)是超氧化物歧化酶中定位于线粒体的一个亚型,具有强的抗氧化作用,可强效清除自由基,使其可能作为辐射防护剂。但天然的MnSOD分子受其自身限制难以直接应用于生物体内,所以MnSOD基因治疗可能有更好的应用前景。本实验利用高表达载体pCE,构建了重组质粒pMnSOD,并通过放射性皮肤损伤细胞和动物模型,探究pMnSOD对放射性皮肤损伤的预防和治疗作用。实验方法:(1)PCR扩增MnSOD DNA片段,与pCE质粒连接构建重组质粒pMnSOD,经发酵、碱裂解及纯化获得pMnSOD,并应用高效液相色谱检测pMnSOD的超螺旋比例。(2)将pMnSOD转染人角质上皮细胞HaCaT细胞,HaCaT细胞经X射线照射后,CCK-8检测细胞活力,流式细胞术检测ROS水平和细胞凋亡率,采用Western Blot检测MnSOD蛋白及凋亡相关蛋白的表达,qPCR检测凋亡、铁死亡相关基因的表达。Erastin诱导HaCaT细胞铁死亡,测定pMnSOD转染后对细胞活力的影响,qPCR检测铁死亡相关基因的表达,探究了 pMnSOD对受照射细胞的保护作用。(3)在治疗实验中单次剂量40Gyγ射线照射雌性SD大鼠,距射源1.5m,大鼠出现症状后(12d)随机分为模型组、pMnSOD低剂量组、pMnSOD中剂量组和pMnSOD高剂量组。各给药组在皮损局部多点皮下注射不同剂量的pMnSOD,1次/周。照后不同时间点以Douglas and Fowler评分标准对大鼠皮肤损伤评分,激光多普勒血流仪检测皮肤血流,ELISA检测血清中细胞因子表达,并进行病理检测,免疫组化检测损伤局部的凋亡相关蛋白的表达,qPCR检测大鼠组织细胞中铁死亡相关基因的表达以观察pMnSOD对大鼠放射性皮肤损伤的治疗作用。(4)在预防实验中,雌性SD大鼠随机分为模型组、pMnSOD低剂量组、pMnSOD中剂量组和pMnSOD高剂量组,各给药组照射前3d给予pMnSOD多点皮下注射,照后第4d再给药1次。照后不同时间点以Douglas and Fowler评分标准对大鼠皮肤损伤评分,并进行病理检测,免疫组化检测损伤局部的凋亡相关蛋白的表达,qPCR检测大鼠组织细胞铁死亡相关基因的表达以观察pMnSOD对大鼠放射性皮肤损伤的预防作用。结果:(1)我们成功构建了重组质粒pMnSOD,经酶切和测序验证序列正确;通过大量发酵、碱裂解和纯化获得了高纯度的重组质粒pMnSOD,超螺旋比例达98%。(2)随着X线照射剂量增大,受照HaCaT细胞活力降低;其中20Gy照射后,HaCaT细胞活力降低50%,确定20Gy为HaCaT细胞照射损伤模型剂量。将pMnSOD转染HaCaT细胞后,受照HaCaT细胞MnSOD表达明显增高,且显著提高细胞活力,细胞内ROS水平明显降低。我们进一步研究了 pMnSOD对受X射线照射的HaCaT细胞活力的保护作用的可能机制,结果显示20Gy X射线照射条件后,转染pMnSOD的HaCaT细胞中SLC7A11基因的表达量高于pCE组,而GPX4基因表达量显著高于pCE组,表明pMnSOD可抑制放射所致铁死亡。为了进一步证明pMnSOD调控铁死亡的作用,我们研究了 pMnSOD对Erastin诱导铁死亡的作用,结果显示Erastin诱导后,转染pMnSOD的HaCaT细胞中MnSOD基因的转录水平明显增高,细胞活力明显增高,且HaCaT细胞中SLC7A11基因的表达水平显著提高。我们又研究pMnSOD对放射所致的细胞凋亡的作用结果显示,转染pMnSOD显著降低受照细胞的细胞凋亡率,Western Blot结果显示,HaCaT细胞中MnSOD表达水平最高,抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达显著升高,促凋亡蛋白Bax蛋白表达有所降低;qPCR结果显示Bcl-2基因表达水平显著增高,而Bax基因表达水平显著降低。(3)pMnSOD对大鼠放射性皮肤损伤的治疗作用研究显示,模型组和各给药组大鼠各时间点体重无显著差别。各给药组与模型组相比皮损评分降低,且呈剂量效应关系;在照后第33天高剂量组皮损评分与模型组相比显著降低。免疫组化结果显示,各给药组皮损局部均有MnSOD蛋白表达,且高剂量组表达明显。给药组皮损局部Bcl-2表达上调,而Bax表达下调。病理学检测结果显示,模型组在照后出现表皮坏死,真皮组织发生肿胀,真皮层胶原纤维被破坏,有大量炎性细胞产生,皮肤损伤严重,而各给药组有不同程度的改善。qPCR结果显示pMnSOD给药组在受照皮肤组织细胞中铁死亡相关基因GPX4、SLC7A11具有高表达,ACSL4基因具有降低的趋势。(4)pMnSOD对大鼠放射性皮肤损伤的预防作用研究显示,照后14d模型组及给药组大鼠皮肤损伤评分无显著差异,而随着大鼠皮肤损伤情况的发展,照后21d、28d、34d给药组评分评分均低于模型组,且具有显著差异(P<0.01)。模型组照射后14天出现脱屑和皮肤干燥,随后在照后21d出现肿胀和红斑,照后28d受照出现局部湿润脱屑和溃疡等,皮肤损伤继续加重,到照后34d仍有明显红斑和红肿溃疡。pMnSOD治疗组大鼠受照皮肤损伤大都未见进一步加重,至照后34d基本恢复正常。照后34d病理学检测结果显示,模型组仍有表皮坏死,真皮层胶原纤维破坏,大量炎性细胞浸润,皮肤损伤仍较严重,而各给药组大鼠皮肤结构完整,已恢复正常。免疫组化结果显示在照射后34天,模型组皮肤SOD2、Bcl-2表达低于给药组,Bax表达高于给药组。qPCR结果显示pMnSOD给药组在受照皮肤组织细胞中铁死亡相关基因GPX4、SLC7A11的高表达和ACSL4基因的低表达。以上结果表明pMnSOD有显著预防大鼠放射性皮肤损伤加重的作用。结论:pMnSOD转染HaCaT细胞后能表达MnSOD蛋白,降低ROS的产生,并显著提高受照射细胞的细胞活力,可能通过抑制细胞铁死亡和凋亡对受照HaCaT细胞起保护作用;通过多点注射裸质粒pMnSOD,可在损伤局部表达MnSOD,对40Gyγ射线诱导的大鼠放射性皮肤损伤具有明显的治疗和预防作用,该作用未见报道。