论文部分内容阅读
目的建立酒精诱导的PC12细胞凋亡模型，观察酒精对PC12细胞神经鞘磷脂循环相关酶活性及其mRNA的表达量的影响，分析神经鞘磷脂循环在神经细胞凋亡中的作用，为进一步研究神经细胞凋亡机制打下基础。方法MTT法测定酒精对PC12细胞增殖的抑制作用；用PI/Hoechst33342染色观察细胞核形态学变化；DNA琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA断裂； RT-PCR法检测酒精对PC12细胞SMS1、SMS2和N-SMase mRNA表达的影响；薄层层析方法测定SMS的活性；荧光分光光度法检测N-SMase的活性；采用高内涵活细胞成像系统检测线粒体膜电位变化；Western-blotting检测酒精致PC12细胞凋亡过程中，凋亡关键蛋白Caspase-3、 Caspase-9表达量变化。结果MTT法结果显示，用100mmoL/L、200mmoL/L、300mmoL/L、400mmoL/L和800mmoL/L浓度的酒精处理去血清培养PC12细胞24h，细胞存活率分别是单纯去血清培养PC12细胞的85.66%、74.28%、62.47%、54.14%和50.35%，呈浓度依赖性，与对照组比较差异显著(P<0·05)。用PI/Hoechst33342染色法观察细胞核形态学变化，有典型凋亡现象出现，凋亡率增加。用酒精浓度为100mmoL/L、200mmoL/L、300mmoL/L和400mmoL/L处理去血清培养PC12细胞24h，DNA琼脂糖凝胶电泳观察100mmoL/L、200mmoL/L、300mmoL/L和400mmoL/L浓度酒精处理组呈现凋亡细胞典型梯状DNA。RT-PCR方法检测酒精对PC12细胞SMS和N-SMase mRNA表达的影响，结果显示，不同浓度的酒精作用0.5h，SMS1在PC12细胞中的表达量没有明显的变化，当反应时间超过1h后，SMS1表达水平显著增加；SMS2的mRNA表达量在8h时下降。不同浓度的酒精作用于PC12细胞1h内，N-SMase活性无明显变化，当作用时间达到2h，N-SMase活性明显提高。不同浓度酒精处理PC12细胞2h，细胞内总SMS活性增高。不同浓度酒精处理PC12细胞24h， PC12细胞线粒体膜电位下降并呈浓度依赖性。不同浓度酒精处理PC12细胞24h，凋亡关键蛋白Caspase-3、Caspase-9表达量升高。结论酒精能诱导PC12细胞凋亡，诱导作用随浓度升高而增强。酒精诱导PC12细胞凋亡与神经鞘磷脂循环有关。酒精作用于PC12细胞使SMS1和N-SMase mRNA表达量增高，酶活性增强，SMS2mRNA表达量下降。酒精诱导PC12细胞凋亡与线粒体途径有关。