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目的1.研究表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate, EGCG)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)、表没食子儿茶素没食子酸酯联合TRAIL对黑色素瘤A375细胞系的体外生长的抑制作用和凋亡作用。2.研究死亡受体4(Death receptor 4, DR4),死亡受体5(Death receptor 5, DR5)在黑色素瘤A375细胞的表达情况。3.研究表没食子儿茶素没食子酸酯对DR4、DR5 mRNA及蛋白表达的影响。4.探讨表没食子儿茶素没食子酸酯对Caspase-3活性蛋白表达的影响。5.研究表没食子儿茶素没食子酸酯单独或联合TRAIL对Caspase-8活性蛋白表达的影响。方法1.体外培养黑素瘤细胞系A375,以不同浓度EGCG、TRAIL对体外培养A375细胞进行干预。表没食子儿茶素没食子酸酯联合TRAIL以甲基噻唑基四唑(MTT)比色法检测EGCG单独或联合TRAIL对黑色素瘤A375细胞系的体外抑制作用。流式细胞术检测各组凋亡率。2.直接免疫荧光法检测黑素瘤细胞系A375 DR4, DR5蛋白的表达。3.以不同浓度EGCG对体外培养黑素瘤细胞系A375进行干预,流式细胞术、RT-PCR、Western blot法分别检测干预处理后黑素瘤细胞mRNA及蛋白表达。4.以不同浓度EGCG对体外培养黑素瘤细胞系A375进行干预,用Caspase-3分光光度法检测干预处理后黑素瘤细胞Caspase-3活性蛋白表达。5.以不同浓度EGCG或EGCG联合TRAIL对体外培养黑素瘤细胞系A375进行干预,Caspase-8分光光度法检测干预处理后黑素瘤细胞Caspase-3活性蛋白表达。结果1. TRAIL、EGCG单独及联合作用对黑色素瘤细胞A375细胞体外生长及凋亡影响。1) EGCG组(0-40μg/ml)浓度范围对A375细胞生长有明显抑制作用,以时间和剂量依赖的模式抑制了细胞存活率。2) TRAIL组(0-150ng/ml)范围内对A375细胞生长有抑制影响,以时间和剂量依赖的模式抑制了细胞存活率,IC50=132.47 ng/ml。3)取TRAIL(25 ng/ml)或EGCG(20μg/ml,40μg/ml)单独或联合作用A375细胞24小时,联合药物组凋亡率高于单独EGCG组,或TRAIL组。亚毒剂量的TRAIL、EGCG及联合作用组致恶性黑色素瘤细胞A-375细胞凋亡率分别为12.8%、5.3-8.1%、49.1-68.9%。单独应用组与联合应用组之间存在显著性差异(P<0.01)。2. A375细胞中DR4和DR5的表达情况及EGCG干预对细胞DR4、DR5的影响1)A375细胞同时表达TRAIL-R1和TRAIL-R2两种受体。TRAIL-R1在A375细胞膜表面为31-40%,TRAIL-R2在膜表面表达为18-23%。2)与空白对照组相比,EGCG单独作用于A375细胞24h后,死亡受体DR4在细胞的表达明显上(P<0.05)。3)干预处理后对A375细胞膜表面DR5蛋白及mRNA无明显影响3. EGCG干预后细胞caspase-3、caspase-8活性的变化1) EGCG干预6h后A374细胞caspase-3活性增强了60.25%。2) EGCG组A375细胞Caspase-8蛋白活性程度无明显改变；同空白组比较,TRAIL联合EGCG作用6h后细胞caspase-8活性增加了55.36%。结论1.研究表没食子儿茶素没食子酸酯联合TRAIL应用对恶性黑色素瘤细胞A-375细胞具有明显的协同杀伤效果。2. TRAIL和EGCG协同作用机制可能与EGCG上调DR4 mRNA及蛋白的表达及增强caspase-3活性有关。