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促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,它和脑垂体促性腺激素分泌细胞的特异性受体结合后刺激促性腺激素(gonadotropin,GtH)的产生和释放,对性腺发育成熟与生殖行为起十分重要的作用。本文利用同源克隆和RACE方法,首次克隆得到斜带石斑鱼三种GnRH基因全长cDNA序列;通过序列比对分析GnRH基因与部分硬骨鱼类结构异同;通过进化树分析GnRH基因与其他脊椎动物的进化关系。使用RT—PCR技术分析GnRH基因在斜带石斑鱼组织分布情况;使用免疫组织化学定位sbGnRH分泌细胞在斜带石斑鱼下丘的分布。通过埋植17α—甲基睾酮(17α—MT)诱导斜带石斑鱼性逆转,采用实时荧光定量PCR的方法,对埋植前后sbGnRHmRNA和sGnRHmRNA在下丘和垂体的变化表达差异进行分析。
主要研究结果如下:
1.克隆的斜带石斑鱼cGnRHⅡcDNA全长603bp,推导出cGnRHⅡcDNA前体由86个氨基酸组成,包括23个氨基酸组成的信号肽,10个氨基酸组成的十肽,50个氨基酸组成的联合肽。克隆的sGnRHcDNA全长519bp,推导出sGnRHcDNA前体由91个氨基酸组成,包括23个氨基酸组成的信号肽,10个氨基酸组成的十肽,55个氨基酸组成的联合肽。克隆sbGnRHcDNA全长432bp,推导出sbGnRHcDNA前体由95个氨基酸组成,包括22个氨基酸组成信号肽,10个氨基酸组成的十肽,60个氨基酸组成的联合肽。氨基酸序列比对表明,cGnRHⅡ保守性最高,sGnRH次之,sbGnRH保守性最低。进行进化树分析表明,斜带石斑鱼的三种GnRH与条斑星鲽、舌齿鲈、金头鲷、乌鱼、大西洋绒须石首鱼、红拟石首鱼、军曹鱼关系较近,特别是与尼罗罗非鱼亲缘关系最近,与人类的亲缘关系较远。
2.组织分布表明,凡与生殖调控有关的区域如嗅球、端脑、中脑、后脑、延脑、垂体和下丘脑、性腺等都有的sbGnRHmRNA表达,表明sbGnRH的表达区域与生殖控制区域是一致的。免疫组织化学技术在下丘检测到sbGnRH分泌细胞。cGnRHⅡmRNA只在中脑有表达,在其他脑区都没有表达。sGnRHmRNA在嗅球、端脑、中脑、延脑表达量较高;下丘脑、垂体、后脑、卵巢、鳃、胃、肾、肠中有微弱表达。结合序列分析和进化树分析,推测sbGnRH在斜带石斑鱼生殖系统中具有重要作用,而cGnRHⅡ和sGnRH不直接参与GtH合成与分泌的调控而是起神经递质作用,间接参与生殖活动的调节。
3.利用MT埋植技术,4周内成功诱导斜带石斑鱼完成性逆转。实时荧光定量PCR表明,下丘脑中的sbGnRHmRNA的转录活性水平在性逆转完全转变成功能性雄性后达到最高峰。推测sbGnRH对于精子发生和维持雄性性行为起重要作用,但是对于卵巢的发育和退化并无重要作用。垂体中,sbGnRHmRNA在性逆转间性时达到高峰,暗示可能性逆转的启动首先需要高水平的sbGnRH在垂体的表达,从而引起下游垂体GtH水平的升高。sGnRHmRNA在下丘脑和垂体中的表达量很低,且性逆转过程中mRNA水平没有明显变化,cGnRHⅡmRNA在下丘脑和垂体中没有表达。据此,推测sbGnRHmRNA是斜带石斑鱼性逆转过程中的下丘脑—垂体—性腺轴起主要作用的类型。