论文部分内容阅读
目的:探索2型糖尿病(T2DM)小鼠模型最佳血糖干预评价点;尝试建立兼具胰岛素抵抗(IR)和β细胞部分损伤特征的T2DM小鼠复合模型。以传统中药验方六味地黄汤和玉泉散为基础,添加相关西药组成中西药降糖复方,开展该复方的降糖药效学研究;通过对该复方基础中药验方拆方,观察配伍药对的降糖效果及其作用机制。方法:1.雄性C57BL/6小鼠高脂饲料喂养4周,用50 mg/kg STZ腹腔注射5次诱导T2DM小鼠,并以健康C57BL/6小鼠作为正常对照。分别测定对照组及T2DM组小鼠12小时内连续空腹血糖和连续随机血糖,分析小鼠血糖规律,评估餐后2小时血糖作为T2DM小鼠血糖干预评价点的科学性;通过对T2DM小鼠餐后2小时血糖进行长达7周的观察,验证了餐后2小时血糖作为药效干预评价点的稳定性,并尝试选取餐后2小时血糖作为后续T2DM小鼠造模评估及药物干预的血糖评价点。2.雄性C57BL/6小鼠高脂饲料喂4周,期间每只小鼠皮下注射1 mg/kg剂量地塞米松,连续2周隔日注射7次,以50 mg/kg STZ腹腔注射5次,尝试建立T2DM复合模型。通过长期观察小鼠饮水、摄食、体重及餐后2小时血糖,评估复合型T2DM小鼠模型的稳定性。通过测定血清胰岛素、计算HOMA-IR及HOMA-β值,评估T2DM小鼠胰岛素抵抗及β细胞功能,探讨复合型T2DM小鼠模型的科学性及临床应用价值。3.以六味地黄汤和玉泉散为基础中药方,分别加入某双胍类(复方一)和某磺酰脲类(复方二)配制成中西药复方,以消渴丸(中西药复方)作为阳性对照药物,开展中西药复方(复方一、复方二)对T2DM小鼠的降糖药效学研究。药效观察期为7周,每周观察小鼠体重、饮水和摄食量及餐后2小时血糖。实验结束后测定各组小鼠血清胰岛素、计算HOMA-IR及HOMA-β值。4.通过对基础中药验方拆方,观察配伍对药的降糖效果及作用机制。共观察葛根&天花粉、熟地&山萸肉、黄芪&生地、葛根&黄芪4组拆方配伍对药。以二甲双胍为阳性对照组,并设立模型和正常对照。药效观察期为7周,每周观察小鼠体重、饮水和摄食量及餐后2小时血糖的动态变化。给药结束后收集血清、胰腺和肝组织,取胰腺组织固定、切片作HE染色做病理观察。采用ELISA法检测:小鼠血清胰岛素(INS)、胰高血糖素(GC)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6),肝脏葡萄糖转运子4(GLUT-4)、胰岛素受体底物1(IRS-1)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、信号转导子与转录激活子5(STAT5)及胰腺STAT5蛋白含量。结果:1.T2DM小鼠连续空腹血糖显示,餐后空腹2至3小时期间血糖水平较高且相对稳定,禁食超过4小时后,T2DM组小鼠血糖大幅度降低。7周内T2DM小鼠餐后2小时血糖稳定。2.高脂饲料、1mg/kg地塞米松联合小剂量多次STZ诱导的T2DM复合模型,模型组小鼠血糖连续4周显著高于正常对照组(P<0.05),且与正常对照组相比有明显的“多饮、多食”症状(P<0.05);HOMA-IR值为22.40±7.31、HOMA-?值为64.70±10.98,与正常对照相比有明显的胰岛素抵抗(IR)和β细胞功能损伤(P<0.05)。3.中西药降糖复方药效观察实验显示:复方一组在给药第4周,血糖降至11.1±3.94 mmol/L,与正常对照组无差异(P>0.05),且血糖稳定至给药第7周;复方二组在给药第5周,血糖降至11.50±4.68mmol/L,接近正常对照组(P>0.05)。模型组小鼠干预第1周,饮水、摄食量明显高于各给药组,第3周开始饮水、摄食显著减少(P<0.05),且体重有明显下降趋势。复方一和复方二组治疗期间饮水、摄食量相对稳定,治疗第5周起小鼠体重明显高于模型组及消渴丸组(P<0.05)。HOMA-IR值:复方一组(3.87±1.13),与正常对照相比无明显差异(P>0.05),且低于模型组(5.17±1.83)及消渴丸组(4.04±1.54);HOMA-β值:复方一组(32.40±10.9)、复方二组(22.90±4.3)、消渴丸组(23.50±6.8)及模型组(20.90±8.0)明显低于正常对照组(80.80±27.5),差异有统计学意义(P<0.05)。实验提示中西药降糖复方(复方一、复方二)对降低T2DM小鼠血糖、缓解T2DM小鼠体重下降有显著作用,且复方一在改善糖尿病小鼠IR方面明显优于消渴丸。4.该降糖复方基础中药验方拆方的配伍对药的药效实验显示:葛根&天花粉组给药第2周开始,血糖明显低于模型组(P<0.05),给药第4周接近正常对照组(P>0.05),降糖效果总体优于二甲双胍组;熟地&山萸肉组给药第2周开始,血糖明显低于模型组(P<0.05),总体血糖变化趋势与二甲双胍组相当,显示拆方配伍对配药能明显降低T2DM小鼠血糖。各给药组干预第3周开始饮水量、摄食量明显少于模型组(P<0.05),显示二甲双胍及中药配伍对药均能有效缓解T2DM小鼠“多饮、多食”症状。HOMA-IR值:模型组及各给药组HOMA-IR值均明显高于正常对照组(P<0.05);葛根&天花粉组(5.47±0.99)、熟地&山萸肉组(6.59±1.07)明显低于模型组(8.40±1.33)及二甲双胍(7.83±1.21),差异有统计学意义(P<0.05),说明葛根&天花粉、熟地&山萸肉能明显改善T2DM小鼠IR,且优于二甲双胍。HOMA-?值:葛根&天花粉组(54.38±11.31)、二甲双胍组(54.18±7.90)、熟地&山萸肉组(45.60±9.07)与正常对照组(67.09±18.23)相比无差异(P>0.05),且明显高于模型组(22.60±9.37),差异有统计学意义(P<0.05)。5.免疫细胞因子及胰岛素信号转导蛋白结果显示,T2DM组小鼠血清TNF-α明显高于正常对照组(P<0.05),各给药组小鼠血清TNF-?与模型组相比无明显差异(P>0.05)。二甲双胍组、熟地&山萸肉组、黄芪&生地组、葛根&黄芪组小鼠血清IL-6含量明显高于正常对照组(P<0.05)。提示,血清免疫因子与小鼠T2DM发生发展有密切联系;在二甲双胍和补肾益气的中药对药治疗中,IL-6可能与药效相关。各给药组小鼠肝脏组织中GLUT-4蛋白含量均明显高于正常对照组(P<0.05),其中熟地&山萸肉、黄芪&生地、葛根&黄芪组小鼠肝脏GLUT-4含量明显高于模型组(P<0.05)。模型组及各给药组肝脏组织中PI3K及AKT蛋白含量明显高于正常对照组(P<0.05);黄芪&生地组小鼠肝脏IRS-1与正常对照组相比明显升高(P<0.05);各治疗组检测指标间多元相关分析显示,IRS-1与PI3K及AKT明显正相关,肝脏STAT5与IRS-1、PI3K/AKT等指标密切相关。提示,二甲双胍、葛根&天花粉、熟地&山萸肉、黄芪&生地、葛根&黄芪改善T2DM小鼠IR和降低血糖的主要机制与上调肝脏GLUT-4和IRS-1/PI3K/AKT信号蛋白的表达、增强葡萄糖转运和胰岛素功能有关。结论:1.本研究首次通过科学合理的实验设计,观察T2DM小鼠12小时内血糖变化规律,发现餐后2小时血糖能长期稳定反映T2DM小鼠高血糖状况,可作为模型评估及药物干预后血糖的最佳观察点。2.本研究首次使用高脂饲料、1mg/kg地塞米松联合小剂量多次STZ诱导T2DM小鼠复合模型,该复合模型中,T2DM小鼠高血糖状态能持续稳定4周,且兼具IR和β细胞部分损伤的特征,是一种能够较完整反映T2DM特征的小鼠模型。相比于单纯高脂饲料加STZ诱导的T2DM小鼠模型,其胰岛素抵抗更明显,具有更好的应用及研究价值。3.本研究中,中西药降糖复方及其基础中药验方的拆方配伍对药能有效降低T2DM小鼠血糖,缓解糖尿病相关症状体征,并能在一定程度上纠正IR和改善β细胞功能。4.本研究中,中西药降糖复方基础中药验方的拆方配伍对药主要机制可能与上调肝脏GLUT4及IRS-1/PI3K/Akt通道蛋白表达水平,缓解肝脏IR和增强调节葡萄糖转运相关。5.本研究发现免疫因子TNF-α、IL-6作为胰岛素信号通路、JAK/STAT信号通路等重要信号通路的上游启动因子,可能对T2DM小鼠肝细胞增殖和修复有一定作用,但其在T2DM发病及药效中的生物学功能还有待进一步研究。