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产毒多杀性巴氏杆菌(toxigenic Pasteurella multocida,T+Pm)是引起猪进行性萎缩性鼻炎(progressive atrophic rhinitis,PAR)的主要致病菌。该病是以面部变形、鼻部扭曲、鼻衄为主要特征的呼吸道传染病,流行十分广泛。病猪生长缓慢,饲料利用率降低,给养猪业造成巨大经济损失。疫苗免疫是预防和控制该病的主要有效措施。T+Pm分泌的皮肤坏死毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)是引起PAR最主要的致病因子。PMT是一个弱免疫原,但当其自然结构被破坏后,其免疫原性会增强。部分截短PMT片段被预测为很好的抗原。本研究根据Gen Bank中已发表的PMT基因(tox A)序列,设计引物,以T+Pm HN-06株基因组DNA为模板,经PCR扩增获得PMT完整基因,并成功构建克隆质粒p MD18-T-PMT。根据DNAStar软件预测分析获得的PMT亲水性基团分布的生物信息,结合相关的研究报道,选取8个不同PMT截短片段作为免疫原性研究的对象。以质粒p MD18-T-PMT为模板,经PCR扩增获得8个截短PMT片段基因,并分别克隆至原核表达载体p ET-32a(+)系统中。PCR鉴定、双酶切鉴定和序列测定结果表明,8个重组PMT片段表达载体均构建成功。以IPTG为诱导剂,分别对8个重组表达菌进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,8个重组PMT片段均成功获得表达,且以包涵体形式表达为主。Western-blotting结果表明,仅重组PMT1-506aa、PMT1-391aa、PMT505-1285aa和PMT973-1285aa片段与PMT抗血清有明显的反应原性。小鼠毒性试验表明,该4个重组PMT片段均不致死小鼠。对反应原性较好的3个PMT片段进行条件优化,以提高其表达量。将PMT1-506aa、PMT1-391aa、PMT505-1285aa和PMT973-1285aa 4个重组PMT片段分别制备疫苗,皮下注射免疫小鼠,间隔14 d进行二免。二免后14 d,用天然PMT进行皮下注射攻毒。结果以2 MLD进行攻毒时,PMT1-506aa(10/10)、PMT505-1285aa(10/10)和PMT973-1285aa(8/10)免疫保护效果显著优于PMT1-391aa(1/10);以5 MLD进行攻毒时,PMT1-506aa(10/10)和PMT505-1285aa(10/10)免疫保护效果显著优于PMT973-1285aa(3/10)和PMT1-391aa(0/10);进一步以10 MLD进行攻毒时,PMT505-1285aa(10/10)免疫保护效果显著优于PMT1-506aa(3/10)。小鼠的免疫保护试验结果表明,4个重组PMT片段中PMT505-1285aa具有较高的免疫保护率。选取重组PMT505-1285aa片段制备疫苗,肌肉注射免疫断奶仔猪,间隔14 d进行二免。二免后14 d,根据建立的仔猪感染T+Pm模型,进行T+Pm HN-06株新鲜菌液(2×1010 CFU)滴鼻攻毒,30 d后剖检观察鼻甲骨病变,结果对照组5/5发生鼻甲骨萎缩,免疫组4/5正常,表明该疫苗对仔猪具有免疫保护作用。同时,应用建立的i ELISA方法,分别对免疫前、一免后14 d、二免后14 d血清进行PMT抗体水平检测,结果对照组0/5发生阳转,免疫组一免后3/5阳转,二免后5/5阳转。综上所述,重组PMT505-1285aa片段的免疫原性较好,具备作为预防PAR候选疫苗的潜在价值。