随着近代饮食结构的变化及人们对补铁的重视,铁缺乏及其危害已获得一定的控制,而铁过载与某些疾病的关系却日渐凸显。近年来,糖尿病和酒精性肝病的发病率都出现显著的回升趋向。很多研究证实在糖尿病及酒精性肝病中有高铁蓄积情况,而铁过载又促进了这些疾病的发生和发展,但是造成这些现象的机制并不十分明确。依赖活性氮的蛋白质硝化因为可以导致蛋白质结构和功能的变化,近年来被认作细胞和机体损伤的一个生物标志物、与许多疾病密切相关。铁过载不仅促成了自由基的产生,还可催化蛋白质的酪氨酸硝化。因此铁过载促进糖尿病肾损伤和酒精肝损伤的分子机理,可能与铁催化蛋白质硝化有一定关联。本文研究了蛋白质硝化在铁对糖尿病肾组织、酒精性肝病肝组织的损伤促进中的作用,及铁对糖酵解中重要酶的硝化和氧化情况,并比较了血红素铁参与的硝化途径和SIN-1硝化途径的蛋白质硝化差异,试图从蛋白质硝化的角度来阐明糖尿病、酒精性肝病等这些疾病中出现的蛋白质硝化水平较高与铁负荷过多的临床病理特点及其相互关系。主要内容如下:(1)铁对糖尿病大鼠肾损伤的促进与蛋白质硝化的关系。通过腹腔注射右旋糖苷铁和链脲霉素制作铁过载-2型糖尿病大鼠模型,运用HE、Western blotting和免疫组化检测正常组、铁过载组、糖尿病组及铁过载糖尿病各个组别中肾组织的损伤及硝化、氧化情况,并结合血糖、铁含量、肾体比及一些氧化应激指标探讨铁过载对糖尿病肾损伤的作用。结果显示,铁过载并没有促使糖尿病血糖水平进一步上升,但可使糖尿病肾组织中的铁含量增加、氧化应激水平上升、硝化程度增强及肾体比增大和肾损伤加重。这些结果表明,铁并非通过促使糖尿病血糖的上升使肾损伤加重,而是使糖尿病的氧化应激增强及蛋白质硝化水平升高,从而促进糖尿病肾损伤。(2)铁过载和酒精联合作用所致小鼠肝损伤中的蛋白质硝化。采用低剂量的铁(300 mg/kg)和酒精(2 g/kg)联合作用建立小鼠肝损伤模型,通过肝损伤的生化指标检测、HE染色、免疫沉淀、和Western blotting探讨低剂量的铁和酒精联合作用对肝损伤影响及蛋白质硝化对其功能的影响,并观察了磷酸丙糖异构酶—与脂代谢联系紧密的一种重要糖酵解酶的硝化情况。研究发现,尽管低剂量铁或酒精独自存在的情况下并未造成肝细胞实质性损伤,但同样剂量的铁和酒精联合作用却能造成肝细胞的损伤,并伴随着肝组织中NADH/NAD+比值显著上升、抗氧化能力减弱、氧化应激增强及蛋白质硝化程度上升。进一步研究发现磷酸丙糖异构酶是易被硝化的一种蛋白,且其硝化将导致酶活性降低以致丧失。实验结果表明,即使低剂量的铁和酒精在单独存在情况下看似对肝组织不会造成实质性损伤,但一旦两者同时存在就明显增大了肝损伤风险。氧化应激造成磷酸丙糖异构酶表达减少和硝化,这都促使磷酸丙糖异构酶活性下降。此外,蛋白质氧化在这过程中同样发挥了重要作用。磷酸丙糖异构酶的失活以及NADH/NAD+比值的增大,促进了磷酸二羟丙酮朝着脂肪合成的原料转化,从而影响糖酵解途径及与脂代谢紧密相关的过程,导致肝代谢紊乱。(3)两种主要硝化途径(ONOO-和铁原卟啉-H2O2-NO2-)引起的磷酸丙糖异构酶硝化的差异及不同天然酚类物质的拮抗硝化作用。通过Western blotting、圆二色谱及液质联用系统比较了 SIN-1和heme-H202-NO2-引起磷酸丙糖异构酶硝化的异同,并比较了 DFO,CA和四种天然酚类化合物拮抗这两种硝化体系中蛋白质硝化作用的差异。结果显示SIN-1引起的蛋白质硝化、氧化均与其浓度呈正相关性,很难区分是硝化还是氧化导致了功能的变化,而heme-NaNO2-H2O2体系中的蛋白质硝化与氧化却呈现出负相关性,证明蛋白质硝化在heme-NaNO2-H2O2体系中存在一定的可控性。在硝化程度相同的情况下,heme-NaNO2-H2O2体系引起酪氨酸硝化的位点比SIN-1多,且蛋白质二级结构的改变小。两种体系引起的硝化均可被DFO和CA抑制,但仅SIN-1体系引起的氧化得到抑制,heme-NaNO2-H2O2体系引起的氧化不仅没被抑制反而被促进了。四种天然酚类化合物拮抗SIN-1体系中的硝化作用与它们清除ABTS+的能力一致,而拮抗heme-NaNO2-H2O2体系的蛋白质硝化却有所不同。这表明SIN-1和heme-NaNO2-H2O2体系引起的蛋白质硝化有所不同,且后者更适合被广泛用来作为抗蛋白质硝化药物的筛选模型。