近年来,由小麦白粉病菌(Blurmeria graminis f.sp.tritici,Bgt)引起的小麦白粉病在全国发病面积广泛,严重影响小麦产量和品质,培育抗白粉病小麦品种并运用到生产实际中显得尤为重要。目前小麦抗白粉病的研究主要致力于发掘抗病基因和病程相关基因,而关于小麦感白粉病基因发掘和感病机制的报道却很少。感病基因就是病原菌诱发寄主感病的过程不可缺少的植物蛋白,包括负向调控抗病反应的感病基因和利于病原菌生长繁殖的感病因子。感病基因突变引起的抗性往往具有持久性和广谱性,如大麦mlo突变体抗大麦白粉菌几乎所有的生理小种,该基因在生产上应用已超过30年,其它物种中该基因突变也可以获得白粉病广谱抗性。本研究利用第二代测序技术对两组抗/感近等基因系材料进行高通量测序,发掘到14个仅在感白粉病材料中受白粉菌诱导后上调表达的感病候选基因,其中包括编码血红素结合蛋白的TaHBP基因、编码具F-box保守结构域的TaFBX基因和一个编码腺苷三磷酸结合盒转运蛋白的TaABC基因。进一步对这三个基因进行了基因表达、进化研究和基于RNAi技术的初步功能验证,研究结果表明这三个感病候选基因在小麦抗白粉病反应中发挥负向调控作用。1.利用第二代高通量测序技术筛选感白粉病候选基因本研究对抗白粉病转基因株系Tstpk-V/感白粉病小麦受体扬麦158和抗白粉病南农9918/感白粉病突变体NM14两组近等基因系材料进行白粉菌诱导处理,提取非诱导、诱导24小时的RNA样品,利用第二代测序技术进行基因表达谱测序,每个材料各获得了超过13万条以上的distinct tag,其中能与小麦unigene数据匹配的特异标签各为2.6万-3.4万。对两组抗感病材料的基因表达谱进行分析,从中发掘出14个仅在两个感病材料感白粉病小麦扬麦158和感白粉病突变体NM14中受白粉菌诱导上调表达、而在2个抗病材料抗白粉病转基因株系Tstpk-V和抗白粉病南农9918中对白粉菌不应答或者受白粉菌诱导下调表达的基因,本研究将这14个基因列为感白粉病候选基因(susceptibility candidate gene,SCG)。2.感病相关基因的生物信息学分析对14个感病基因中的三个具有推导功能的基因进行了生物信息学分析,这三个基因包括编码血红素结合蛋白的HBP基因TaHBP、编码F-box蛋白的FBX基因TaFBX和一个编码腺苷三磷酸结合盒转运蛋白的ABC基因TaABC。TaHBP基因位于小麦染色体7A短臂上,编码保守的血红素结合蛋白结构域(SOUL/Heme-binding protein)。TaFBX位于小麦染色体5A长臂上,编码一个Phloem protein蛋白结构域,属于PP2超家族。TaABC位于小麦第六同源群上,蛋白质序列属于植物的类PKc超家族。3.感白粉病候选基因的表达特征分析由于本研究使用的两个抗病材料具有广谱抗性,其中南农9918含有Pm21基因,抗白粉病转基因株系Tstpk-V中的超量表达基因Stpk-V是来自Pm21位点的关键基因,所以本研究进一步分析了三个感白粉病候选基因在含有Pm21基因的材料中受白粉菌诱导表达的情况。选择了 3个不同生态区的含Pm21基因的抗病材料,包括石麦14(河北石家庄)、内麦8号(四川内江)和兰天17(甘肃天水),利用QRT-PCR方法分析了感白粉病候选基因在这些材料受白粉菌诱导前后的表达情况。结果显示:TaHBP在这些材料中受诱导24小时后的表达量明显降低;TaFBX在石麦14和内麦8号中的表达量下降,而在兰天17中表达量几乎没有变化;TaABC受白粉菌诱导后的表达量在三个材料中都出现了明显的下降。基因表达分析结果表明TaHBP和TaABC在Pm21介导的抗病反应中可能起负向调控的作用。为了研究这三个基因在其他Pm基因抗性途径中的表达模式,进一步选择了携带Pm2和Pm4a的抗白粉病小麦,利用QRT-PCR方法分析它们的表达情况。结果表明:TaHBP和TaABC在这两个材料受白粉菌诱导24小时后都出现明显的下调表达;TaFBX在含Pm4a的抗白粉病小麦材料中,表达量明显降低,而在含Pm2的材料中,诱导后的表达量为诱导前表达量的80%,相比Pm4a下降幅度较小。TaHBP、TaFBX和TaABC在Pm2和Pm4a介导的白粉病抗病通路中可能也具有一定的负向调控功能。4.感白粉病候选基因的功能分析为了研究TaHBP、TaFBX和TaABC三个基因在白粉病抗病途径中的作用,本研究利用TIGS(transient induced gene silencing)瞬间表达技术和RNAi转基因技术,在单细胞水平和植株水平分别沉默三个基因,并通过叶片表皮单细胞吸器指数的统计和转基因植株的抗病性鉴定,对三个基因进行初步的功能分析。研究结果表明:扬麦158叶片单细胞水平上沉默这三个基因都可使白粉菌的吸器指数下降,其中沉默TaHBP后吸器指数由51.1%降为40.2%,沉默TaFBX后吸器指数由51.8%降至43.8%,沉默TaABC后吸器指数由52.4%降至43.5%。进一步将三个基因的RNAi载体导入受体扬麦158中,创造基因沉默的转基因植株。对TaFBX的RNAi T0代植株进行苗期离体鉴定,发现3棵抗性提高的植株,通过T1代苗期和成株期抗性鉴定发现,这三个株系出现抗感分离,PCR扩增和基因表达分析结果显示,TaFBX沉默的阳性植株,抗性都得到了提高,说明TaFBX参与到抗白粉病过程中,并且起负向调控的作用。在TaABC的RNAiT1代的鉴定中出现四个抗感分离的株系,这些株系对应的T0代植株也有较高的抗病性,PCR鉴定结果显示,成功导入RNAi载体的T1代植株抗病性得到提高,说明TaABC参与到抗白粉病途径中,并且发挥负向调控作用。TaHBP的RNAi T0代植株有218株,对其中种植在田间的48棵转基因植株进行了 PCR鉴定获得3棵阳性植株,基因沉默植株的抗病性是否有变化有待用T1代阳性转基因植株进行抗病性鉴定。综上所述,选择抗感材料近等基因系进行高通量测序是筛选感病基因的一种可行手段,其遗传背景的高度一致性可提高感病基因筛选效率;获得感白粉病候选基因后,利用RNAi技术在感病材料中沉默这类基因可以提高感病小麦的白粉病抗性,为小麦抗病育种提供新基因资源。