论文部分内容阅读
本研究以低温脱脂豆粕为原料,采用优化后的Nagano法分离制备7S和11S大豆球蛋白。选取Alcalase碱性蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶水解分离得到的7S和11S大豆球蛋白制备抗氧化活性的肽。通过大豆球蛋白酶解液体外抗氧化活性的测定筛选出水解液抗氧化性较高的蛋白酶类,利用正交试验优化了其水解大豆球蛋白的反应条件。在最适水解条件下制备抗氧化活性肽水解物,进行水解产物中抗氧化活性肽的分离,选取抗氧化活性较强的肽组分,利用高效凝胶色谱法分析其分子量分布,并对其氨基酸组成进行分析。利用优化后的Nagano法分离制备7S和11S大豆球蛋白通过SDS-PAGE电泳分析可知,分离得到7S和11S大豆球蛋白的相对纯度分别达到83.68%和87.59%。选取五种蛋白酶分别在各自最适水解条件下水解分离得到的7S和11S大豆球蛋白,水解时间为1h、2h、3h、4h和5h,以保护因子、对DPPH自由基清除率和水解度为指标综合考虑,从五种蛋白酶中筛选出水解大豆球蛋白抗氧化活性较高的酶类为Alcalase碱性蛋白酶,其优化的水解大豆球蛋白的条件为:温度55℃,pH值8.0,加酶量为5%([E]/[S]),底物浓度为4%。随着水解时间的延长,Alcalase碱性蛋白酶对蛋白的水解度在增加,但是水解产物的抗氧化活性是先增大后减小,水解时间为4h时的水解产物体外抗氧化活性最高,7S和11S大豆球蛋白酶解物保护因子分别为1.48和1.46,DPPH自由基清除率分别为60.85%和58.15%。用超滤和凝胶层析对大豆球蛋白水解物中具有抗氧化活性的肽进行分离。水解液用超滤膜分级后,获得了分子量大于30kDa、10kDa-30kDa、5kDa-10kDa和小于5kDa的组分。11S和7S球蛋白Alcalase碱性蛋白酶水解物分子质量小于5kDa组分的多肽分子质量主要集中在1000Da以下,分别占92.92%和87.53%,含量分别约为82.6%和89.1%。通过抗氧化活性和DPPH自由基清除率的测定比较分析,得到小于5kDa组分抗氧化活性最好。经Sephadex G-25凝胶层析对7S和11S大豆球蛋白酶解物超滤后得到的该组分进行进一步分离,得到A、B、C、D四个组分样品中,组分A的抗氧化活性最好,四个组分的抗氧化活性次序依次为A>C>B>D。分别以牛血清白蛋白、VB12和还原型谷胱甘肽为标准物质制作标准曲线,根据凝胶层析标准曲线得到公式Y=-0.0135X+5.1889。由此所得公式大致推算峰A的分子量大概为1068.81 Da。