第一部分线粒体自噬对颅脑外伤后神经炎症反应和神经元凋亡的调控作用目的:研究颅脑外伤后线粒体自噬的发生情况和具体机制,探讨其和神经炎症反应之间的关系。方法:运用临床标本,以癫痫患者的脑组织为对照组,通过电镜和western blotting等方法检测颅脑损伤后脑组织的自噬及线粒体自噬发生情况;以WT和GFP-LC3转基因Sprague Dawley老鼠为研究对象,运用控制性皮层损伤方法,构建颅脑损伤的动物模型;通过免疫荧光、western blotting、电镜等检测线粒体自噬的发生情况;使用BAF和3-MA两种不同的自噬抑制剂,检测其对颅脑外伤后线粒体自噬的影响;依据外伤后1、3、6以及24小时,取脑组织检测线粒体自噬和线粒体释放Cyt C的情况,研究线粒体自噬和细胞死亡在时间上的关系;检测正常状态下和颅脑外伤后心磷脂在线粒体上的分布情况;抑制PLS3或者CLS,干扰心磷脂的重新分布,检测其对颅脑外伤后线粒体自噬的影响;使用线粒体自噬抑制剂mdivi-1,Sprague Dawley大鼠分为sham组,TBI组和TBI+mdivi-1组;TUNEL和western blotting检测损伤后细胞凋亡情况;脑缺损面积实验,检测脑组织损伤情况;平衡木实验和水迷宫实验,探讨外伤后神经功能恢复情况。结果:1,电镜显示颅脑外伤后大量损伤的线粒体被双层膜包裹,提示显著增加的线粒体自噬;2,western blotting显示自噬的标志蛋白LC3-Ⅱ明显升高,p62下降,线粒体的标志蛋白(COXIV,MnSOD,TOM40)下降;3,免疫荧光显示GFP-LC3和线粒体共定位明显增加;4,线粒体自噬发生早于Cytc从损伤线粒体释放;5,心磷脂由线粒体内膜翻转至外膜,与LC3结合,阻止心磷脂外翻,抑制颅脑外伤后线粒体自噬;6,抑制线粒体自噬加剧颅脑损伤后神经炎症反应;7,抑制线粒体自噬使脑缺损面积增加;8,干扰大鼠神经功能恢复,影响平衡木实验和水迷宫实验。结论:1,颅脑损伤后,脑组织线粒体自噬显著增加;2,线粒体自噬早于细胞凋亡的发生;3,心磷脂充当识别损伤线粒体的作用,调节线粒体自噬;4,线粒体自噬起神经保护作用,抑制线粒体自噬会加剧神经炎症反应,阻碍神经功能恢复。第二部分NLRP3炎症小体在颅脑外伤中的重要作用目的:研究颅脑外伤后神经炎症反应的发生情况,探讨NLRP3在其中的重要调节作用,及与预后的关系。方法:运用临床标本,以癫痫患者的脑组织为对照组,通过免疫组化和western blotting等方法检测颅脑损伤后脑组织的神经炎症发生情况;运用siRNA敲低NLRP3后,western blotting检测敲低效果,研究其对颅脑外伤后神经炎症反应的影响;以WT、及NLRP3-/-caspase-1-/-、IL-1R-/-转基因小鼠为研究对象,构建控制性皮层损伤模型,平衡木实验和水迷宫实验,探讨颅脑外伤后肌力、运动、学习、记忆、认知等神经功能恢复情况。结果:1,免疫组化显示颅脑外伤后NLRP3、IL-1β和IL-18表达增加,提示显著增强的神经炎症反应;2,western blotting结果显示caspase-1(P20)和分泌型IL-1β明显增加;3,运行siRNA敲低nlrp3,使nlrp3低表达,后续western blotting结果显示caspase-1(P20)和IL-1β明显减少;4,在平衡木实验和水迷宫实验中,与WT小鼠相比,NLRP3-/-caspase-1-/-、IL-1R-/-转基因小鼠的外伤后神经功能恢复更好。结论:1,颅脑损伤后,NLRP3表达增加,神经炎症反应明显增强;2,敲低NLRP3,显著减少颅脑外伤引起的神经炎症反应;3,敲除NLRP3,或者caspase-1,或者IL-1R有利于颅脑外伤后神经功能恢复。第三部分Omega-3通过调节NLRP3介导的炎症反应减少颅脑外伤后细胞死亡和改善预后目的:探讨omega-3如何抑制颅脑外伤后神经炎症反应,及改善颅脑损伤后神经功能缺陷。方法:合笼后第1天,雌鼠被随机分配接受标准食物(EPA 20:5 n-3 0.02%和DHA22:6 n-3 0.02%),或高 co-3 Fas 的饮食(EPA5.3%和 DHA23.8%),或者高ω-6 Fas 的饮食;术前 6 周予以 co-3(DHA,22:6,#D2534),或者 ω-6(oleic acid,18:2,#62160),或者 ω-9(linolenic acid,18:1,#01008),或者生理盐水灌胃,2 次/周;通过ELISA、western blotting等检测不同组的颅脑外伤后神经炎症反应;使用GPR40受体拮抗剂GW1100或者siRNAGPR40,抑制ω-3 Fas的抗炎的作用;通过免疫共沉淀检测ARRB2与NLRP3结合情况;分离线粒体和胞浆蛋白,检测NLRP3和线粒体共定位情况;TNUNEL检测颅脑外伤后细胞死亡情况,同时使用western blotting检测cleaved-caspase-3表达水平;使用脑水肿实验和脑缺损面积,检测脑损伤情况;使用平衡木实验和水迷宫实验探讨外伤后神经功能恢复情况。结果:1,与sham组相比,ELISA结果显示co-3Fas抑制颅脑外伤诱导的IL-1β、IL-18 和 IL-6;2,omega-6 或-9 不能抑制 caspase-1 和 IL-1β的激活;3,siRNA GPR40或者GW1100能够显著抑制ω-3Fas的抵抗炎症作用;4,免疫共沉淀结果显示ω-3Fas促进GPR40下游蛋白ARRB2与NLRP3相结合;5,分离线粒体蛋白和胞浆蛋白,后续western blotting结果显示ω-3Fas抑制NLRP3与损伤的线粒体结合,从而减少cleaved-caspase-1和IL-1β的表达;6,ω-3Fas可显著减少颅脑外伤引起的细胞死亡;7,ω-3Fas减少颅脑外伤引起的皮层缺损和脑水肿,促进运动和认知能给恢复;8,GW1100抑制ω-3Fas对于颅脑外伤的神经保护作用。结论:1,ω-3Fas改善脑外伤引起的神经炎症反应和神经功能行为缺陷;2,ω-3Fas通过GPR40促进ARRB2与NLRP3相结合,并抑制NLRP3与损伤的线粒体结合,从而减少创伤性神经炎症反应;3,ω-3Fas通过GPR40/ARRB2/NLRP3信号通路有效减轻脑水肿和脑皮层缺损,促进颅脑外伤后神经功能恢复。