L-半胱氨酸与L-色氨酸是两种重要的氨基酸,广泛应用于医药、食品和饲料等行业。近年来,各行业对L-半胱氨酸与L-色氨酸的需求量日益增加,而现有产量远不能满足国内外市场的需求。因此,开发微生物酶法生产L-半胱氨酸与L-色氨酸的工艺路线具有广阔的应用前景。 本实验室从富含DL-ATC的环境中筛选获得一株恶臭假单胞菌TS1138菌株,前期研究表明,该菌株能以DL-ATC为底物酶法合成L-半胱氨酸。 本研究建立了以TS1138菌体全细胞为酶源,重复利用酶源细胞连续多次转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的生产工艺。首先对酶促反应条件进行了优化,确立最适反应条件为：反应温度,42℃；反应体系pH,8.0;反应时间,2.5 h;底物浓度,0.6％；细胞悬液浓度,250g/L;反应体系中羟胺浓度,1 mmol/L。在最适反应条件下,底物的转化率可达到95.6％,并且在酶源细胞的6次重复利用过程中,底物的转化率均保持在90％以上。随后建立了产物L-半胱氨酸的分离纯化工艺,先以DMSO为氧化剂将酶促反应液中的L-半胱氨酸氧化成L-胱氨酸,之后经树脂吸附、等电点沉淀等方法纯化获得L-胱氨酸,纯度达到99.1％,收率为78.6％；最后再通过电解还原的方法获得L-半胱氨酸。 此外,本研究还建立了以L-半胱氨酸为原料,利用色氨酸酶转化L-半胱氨酸和吲哚合成L-色氨酸的生产工艺。首先克隆了大肠杆菌JM109菌株的色氨酸酶基因,并将其在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。通过对诱导表达条件的优化,重组表达的色氨酸酶活力达到宿主菌的约110倍。随后利用高效表达色氨酸酶的大肠杆菌酶源细胞,以L-半胱氨酸和吲哚为底物,进行了酶促反应合成L-色氨酸的工艺研究。对酶促反应条件进行了优化,确立最适反应条件为：反应温度,45℃；反应体系pH,8.5;反应时间,3 h;底物浓度,10g/L L-半胱氨酸与10g/L吲哚；酶源细胞浓度,20g/L;辅酶磷酸吡哆醛浓度,0.15g/L。在最适反应条件下,L-半胱氨酸的转化率为81.5％,吲哚的转化率为79.1％。最后建立了L-色氨酸的分离纯化工艺,通过串联使用两种树脂排除反应液中其它物质的干扰,再经洗脱、减压浓缩干燥,获得L-色氨酸,纯度达到98.3％,收率为66.7％。 综上所述,本研究分别建立了L-半胱氨酸和L-色氨酸的微生物酶法生产工艺,为最终实现以DL-ATC为底物酶法合成L-半胱氨酸和L-色氨酸的生产应用奠定了基础。