植酸酶appA NR基因在克鲁维乳酸酵母中的表达及酶学性质分析

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植酸是肌醇的6个羟基均被磷酸酯化生成的肌醇衍生物,广泛存在于植物组织和粮食产品中,是植物性饲料中磷的主要存在形式,在谷物和豆类中其含量超过总磷的80%。植酸常与人和动物所需的矿质元素Ca2+Mg2+Zn2+Fe3+等金属离子以及蛋白质形成复合物降低了矿质元素和蛋白质的吸收利用率。植酸酶主要存在于植物种子和微生物中,它可以将植酸分解为肌醇和磷酸,解除植酸的络合性和对酶类的抑制,从而提高食品和饲料的营养价值和生物利用率。又因为单胃动物的胃、肠道环境中缺乏植酸酶,无法被分解利用的植酸磷就随着粪便排出造成环境的污染。植酸的酶解产物有非常重要的营养价值和药用阶值,开发和利用植酸酶对食品工业,饲料工业和畜牧业的发展均有重要的意义。微生物产生的植酸酶虽具有良好的开发前景,但其天然菌株产酶水平较低,加上某些性质不能完全适合饲料加工、食品和医药生产的要求,从而限制了植酸酶的推广应用。本研究将实验室保存的植酸酶基因appA NR克隆到克鲁维乳酸酵母GG799菌株表达载体pKLAC2中,得到重组表达载体pKLAC2-appA NR,植酸酶基因appA NR是来源于E.coli K12的植酸酶基因appA根据酵母密码子偏好性进行优化得到的。pKLAC2-appA NR经Sac Ⅱ线性化后用化学法转化克鲁维乳酸酵母GG799,利用YCB筛选平板和菌落PCR方法筛选得到重组菌株。将筛选出的重组菌株接入到YPGal液体培养基中进行诱导培养,通过SDS-PAGE凝胶电泳检测表达产物,得到一条约60-65kDa的特征条带。对重组植酸酶appA NR的酶学性质分析表明最适反应温度为55℃,在45℃-60℃之间,酶活维持在75%以上;90℃高温处理10分钟后酶活仍保留在84%以上耐热性较好。最适pH为5.5,在pH2.0-6.5的酸性pH范围内有较强的酶活性。pH耐受性较好,pH2.5-7.5相对酶活均在80%以上。克鲁维乳酸酵母表达的植酸酶appA NR对胃蛋白酶和胰蛋白酶均有着较强的耐受性,用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理120min后残留酶活分别为87.3%和79.5%。
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