第一部分 血管紧张素(1-7)对非酒精性脂肪性肝炎小鼠的治疗作用研究背景:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝脏损伤,除外乙醇和其他明确的肝损伤因素,以弥漫性肝大泡性脂肪变,伴或不伴炎症为主要特征的临床病理综合征,包括单纯性脂肪肝以及由其演变而来的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化以及肝硬化。NAFLD是21世纪全球重要的公共健康问题之一,随着我国人民饮食结构和生活方式的转变,NAFLD发病率近年来逐年增加,已经成为我国常见的慢性肝病之一。NAFLD通常合并高脂血症、肥胖症以及糖尿病。其中,肥胖症与NAFLD密切相关,有关研究显示,肥胖者患NAFLD的风险增高4.6倍。NAFLD可以发生于各色人种以及不同年龄组的病人。据有关资料显示,在西欧、美国、日本等国家,普通人群NAFLD发病率为10%-24%,NASH患病率平均为3%,而肥胖者NAFLD发病率高达57.5%-74%。我国发达地区NAFLD的发病率与发达国家相似。临床上,大量研究提示,NAFLD病人不仅会导致肝病相关残疾甚至死亡,而且与心脑血管发生事件密切相关。NAFLD病人一开始表现为单纯性脂肪肝,少部分病人会进展为NASH,而NASH是单纯性脂肪肝向肝纤维化、肝硬化、门脉高压、肝脏肿瘤发展的重要环节,对病人危害极大。然而,目前对于NAFLD/NASH的发病机制尚不完全明确,治疗上只能尽量去除病因和诱因,然后依靠自己通过改变生活方式(如节食、运动、戒烟、禁酒等)来控制病情的进一步发展。临床上并没有专门治疗NAFLD/NASH的药物和方法。因此,深入探索NAFLD/NASH的发病机制、寻找合理有效的预防以及治疗措施具有十分重要的意义。NASH的发病机制尚不十分明确,它与代谢综合征密切相关,是代谢综合征在肝脏的局部表现。“二次打击学说”是NAFLD/NASH发生、发展机制的经典学说,即首先是胰岛素抵抗和代谢综合征导致患者出现单纯性脂肪肝,在单纯性脂肪肝的基础上,由于各种有害因素作用于肝脏,主要是氧化应激及活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)生成增加,导致肝脏脂肪酸氧化异常、肝细胞损伤甚至死亡,即出现NASH的表现。其发生的病理机制较为复杂,涉及包括肝脏在内的全身多个系统。因此,寻找一个能够作用于机体多个相关系统的药物靶点,这是研究治疗NASH的一个关键基础。我们所熟知的肾素血管紧张素系统(RAS)存在于包括循环系统在内的全身多个组织器官,涉及影响NASH的肝脏、内分泌、心脑血管等多个系统,是目前国内外研究的热点问题,可能也是NASH发生机制研究较合适的靶点。经典的ACE-AngⅡ-AT1R轴途径在调节血压、氧化应激、促炎等方面发挥着重要作用,除了这一些重要组分外,血管紧张素转换酶2(ACE2)、血管紧张素1-7(Ang(1-7))、Ang(1-7)的受体Mas是近年发现的RAS系统的新组分。它们构成新的ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴,ACE2与ACE虽同属一家族但功能却大不相同。ACE2可以将血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)分别裂解产生Ang(1-9)和Ang(1-7)。目前认为,ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴是经典途径ACE-AngⅠ-AT1R轴的内在负调节途径。Ang(1-7)与其Mas受体结合可拮抗AngⅡ从而发挥抑制炎症及抗氧化等多方面的作用。因此,我们拟在这方面做初步研究,观察Ang(1-7)对NASH的作用,为进一步探索NASH的发病机制及完善临床治疗策略提供新的思路。目的:我们采用C57BL/6小鼠作为实验对象,利用蛋氨酸-胆碱缺乏(Methionine-Choline deficient,MCD)饲料饮食构建非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型,同时给予持续腹腔注射Ang(1-7)治疗。造模六周后探讨NASH模型的特点和肝脏病理学特征以及观察Ang(1-7)对NASH的作用。以期为探索NASH的发病机制,寻找合理有效的预防以及治疗措施奠定一定的基础。方法:24只C57BL/6小鼠,购买于南方医科大学实验动物中心,所有小鼠经过适应性喂养1周后随机分为以下4组:①MCS对照组6只,给予蛋氨酸-胆碱充足(Methionine-Choline sufficient,MCS)饲料饮食,无其他干预措施;②MCD组6只,给予MCD饲料饮食,无其他干预措施;③MCD+Ang(1-7)组,6只,在给予MCD饲料饮食的同时,通过在小鼠腹腔内埋入装有Ang(1-7)的植入式渗透压微量泵,持续给小鼠腹腔注射Ang(1-7)(25ug/kg/h);④MCD+NaCl组,6只,在给予MCD饲料饮食的同时,通过在小鼠腹腔内埋入注有生理盐水的植入式渗透压微量泵,持续给予小鼠注射NaCl,作为MCD+Ang(1-7)组的对照。所有实验动物均分笼饲养于25±2℃、明暗各12小时的SPF级动物饲养房中,自由进食进水,造模时间共6周。每周记录体重一次。造模结束后麻醉小鼠,分离血清,处死小鼠。小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)生化指标通过全自动生化分析仪进行测定。观察小鼠肝脏的大体情况,并完整分离小鼠肝脏,称肝脏湿重,拍照;通过油红O染色、H&E染色评估各组小鼠肝脏细胞脂肪变、细胞气球样变性以及炎细胞浸润情况,并采用NAFLD活动度积分(NAFLD Activity Score,NAS)对各组每只小鼠进行评分,总体评价各组小鼠肝脏NASH严重程度。最后运用相关统计学方法进行统计分析,比较各组之间的差异。统计学方法:统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,组间差异的比较采用两样本t检验(Independent-Samples T Test),实验数据采用均数±标准差(x±s)表示,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果:1、小鼠一般情况。6周后,各组小鼠均无死亡,与MCS对照组相比,MCD组和MCD+NaCl组小鼠的毛发紊乱、无光泽,活动减弱,精神萎靡,而MCD+Ang(1-7)组程度有所减轻。MCS对照组小鼠体重从第二周开始逐渐增加并最终趋于稳定水平,而MCD饲料饮食的各组小鼠从第二周开始体重逐渐减少并最终也趋于稳定水平。2、小鼠血清 ALT、AST 水平。MCD 组小鼠血清 ALT(309.67±232.31)、AST水平(428.21±137.74)和 MCD+NaCl 组(278.07±209.04;320.97±177054)相类似,较MCS对照组(31.50±10.77;117.25±16.76)显著升高(P<0.05),与模型组相比,MCD+Ang(1-7)组(140.87±60.18;224.55±31.23)小鼠血清 ALT、AST 有下降的趋势,但尚无统计学差异。3、肝脏组织病理学变化。肝脏大体观察,MCS对照组小鼠肝脏未见肿胀增大,色深红,质软;而MCD组和MCD+NaCl组小鼠肝脏体积明显缩小,颜色为土黄色,质韧。MCD+Ang(1-7)组小鼠肝脏较之有所减轻。各组小鼠肝脏H&E染色结果显示,MCS对照组小鼠个别存在轻度肝细胞脂肪病变外,其余基本无肝细胞脂肪变、气球样变性以及炎症灶。而MCD组和MCD+NaCl组肝细胞脂肪变及气球样变性显著,并可见散在炎症病灶。与MCD组和MCD+NaCl组相比,MCD+Ang(1-7)组肝细胞脂肪变、气球样变以及炎症均有所改善,NAS评分(2.833±0.7528)较 MCD 组(5.500±0.5477)和 MCD+NaCl 组(4.833±0.7528)降低(P<0.05)。油红O染色结果显示,MCS对照组个别小鼠肝细胞有少量脂滴沉积,MCD 组和 MCD+NaCl 组脂滴沉积明显,而 MCD+Ang(1-7)组(38.33±19.408)脂滴沉积情况较MCD组(65.00±10.488)和MCD+NaCl组(68.33±16.021)有所改善(P<0.05)。结论:本研究采用MCD饲料喂养C57BL/6小鼠6周后成功地建立非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型,通过腹腔持续注射Ang(1-7)能有效改善NASH的发生发展,为NASH的治疗提供新的靶点和思路,也为我们下一步研究Ang(1-7)影响NASH的发生发展机制提供了研究模型。第二部分血管紧张素(1-7)对非酒精性脂肪性肝炎小鼠治疗作用的机理初探研究背景和目的:众所周知,“二次打击学说”是NAFLD/NASH发生、发展的重要机制,包括以胰岛素抵抗为主的“一次打击”和以氧化应激为主的“二次打击”。“第一次打击”主要为胰岛素抵抗及代谢综合征导致肝细胞脂肪沉积,肝细胞受损,出现单纯性脂肪肝病变。“第二次打击”是指内毒素、游离脂肪酸(FFA)等有害因素诱发氧化应激及肝脏线粒体功能失调,线粒体活性氧物质(ROS)增多,抑制肝脏脂肪酸氧化,肝脏脂质的过度沉积,引起脂质过氧化及多种炎症因子释放,诱导肝脏出现一系列的炎症反应并使肝细胞受损甚至细胞坏死,从而出现NASH病变。可见,肝脏氧化应激及线粒体功能失调导致ROS生成增多是NASH的一个关键因素。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(NOX)是细胞ROS的主要来源,NOX家族主要包括 NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1 和 DUOX2。细胞内 NOX可促进线粒体ROS的产生。有关研究提示,许多细胞因子,如血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)、AngⅡ、脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)、白介素-1 β(Interleukin-1 β,IL-1 β)与肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)等,可以通过刺激机体使ROS生成增多,这些细胞信号与相应的受体作用后,激活下游一系列信号通路,进而参与机体多方面功能的调节。ROS与细胞的分化与生长、增殖、凋亡等细胞活动密切相关。在肝脏,氧化应激以及ROS生成增加可诱发炎症反应,这构成了 NASH发生、发展的病理生理基础。炎症小体(Inflammasome)是一种蛋白复合体,主要有NLRP3、NLRP1、AIM2以及RIG-Ia四种。NLRP3炎症小体是目前国际上研究比较热门的一种,主要由模式识别受体和凋亡相关的斑点蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein,AS C)和天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-1)组合而成。当细胞内外多种危险信号激活NLRP3炎症小体后,它能够促进Caspase-1的活化,进而在免疫防御的过程中促进细胞因子前体pro-IL-1β和pro-IL-18的切割成熟,产生有活性的IL-1β和IL-18并释放到细胞之外,引发下游一系列的炎症反应。NLRP3炎症小体是机体固有免疫的重要组分,在机体免疫反应和多种疾病的发生及发展过程中都发挥着重要作用,包括糖尿病、动脉粥样硬化以及阿尔兹海默病等。而近年来研究提示线粒体功能失调以及ROS的产生与NLRP3炎症小体的激活关系密切。当发生各种损伤因素时,细胞处于氧化应激,线粒体形态变化及功能紊乱。引起线粒体ROS生成增加,线粒体DNA释放,这些因素均有可能激活NLRP3炎症小体,诱发肝细胞一系列炎症反应的发生,抑制脂肪酸氧化,导致细胞损伤甚至死亡,对肝脏发挥一系列的损伤作用。RAS系统的重要组分包括肾素、血管紧张素转换酶(ACE)、血管紧张素原、AngⅠ、AngⅡ、醛固酮、血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)等构成了经典的ACE-AngⅡ-ATR轴。肾小球旁器分泌肾素,而ACE能将无活性的AngⅠ转换为有活性的AngⅡ,AngⅡ作用于AT1R受体,从而发挥一系列的生理病理作用。RAS系统存在于包括循环系统在内的肾脏、肺脏、心脏等全身多个组织器官,涉及影响NASH的内分泌、心脑血管等多个系统,是目前国际上研究的热点问题,也是NASH发生发展机制研究的合适靶点。现已证明RAS系统不只是存在于循环内分泌系统,局部组织如肝脏也存在RAS系统,慢性肝脏疾病患者肝脏ACE-AngⅡ-ATR轴常处于上调状态。作为RAS系统最重要的效应分子,AngⅡ与代谢综合征及NAFLD的发生、发展有非常密切的联系,AngⅡ不仅可以影响血压、血糖、血脂代谢,还在肝脏的损伤和纤维化中起到非常重要的作用。有关研究结果显示,在肝脏中,AngⅡ能通过引起NOX4活化从而促进ROS的产生。而近年来发现了 ACE2、Ang(1-7)、Mas受体等许多RAS系统的新组分。它们构成的ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴,成为RAS系统的另一重要分支,目前认为是ACE-AngⅡ-AT1R轴的内在负调节途径,ACE2与ACE虽同属一族但功能却大不相同。ACE2将AngⅠ和AngⅡ分别裂解产生Ang(1-9)和Ang(1-7)。Ang(1-7)与其Mas受体结合可抑制AngⅡ的许多生理作用,如具有抑制炎症及抗氧化作用,而ACE2多通过其酶解产物Ang(1-7)发挥抗氧化作用。因此,在肝脏中,Ang(1-7)能否通过降低NOX4的表达来减少ROS的产生,进而抑制NLRP3的活化,最终减缓NASH的进展。本文对此展开初步研究。方法:体内实验:因为NLRP3活化后会激活Caspase-1,因此,我们通过检测Caspase-1水平来反映NLRP3活化水平。应用免疫组化技术检测各组小鼠NOX4、ASC、Caspase-1表达水平;Western blot技术检测各组小鼠NOX4表达水平,比较各组间的差异。利用透射电镜技术(TEM)观察肝窦内皮细胞(SEC)、肝细胞内细胞器等超微结构的变化;体外实验:采用小鼠正常肝细胞系AML12进行以下实验:(1)AngⅡ(10-7mol/L)时间梯度对 Caspase-1 的影响,分组:Control、AngⅡ(6、12、24h);(2)Ang(1-7)(10-7mol/L)时间梯度对 Caspase-1 的影响,分组:Control、Ang(1-7)(6、12、24h);(3)AngⅡ、Ang(1-7)对 ROS 的影响,分组:Control、Ang(1-7)、AngⅡ、Ang(1-7)+AngⅡ。统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,组间差异的比较采用两样本t检验,实验数据采用均数±标准差(X±s)表示,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果:1、体内实验:免疫组化结果提示,MCD组和MCD+NaCl组相对于MCS对照组NOX4、ASC、Caspase-1表达明显升高,而与MCD组和MCD+NaCl组相比,MCD+Ang(1-7)组NOX4、ASC、Caspase-1表达相对较低;Western bolt结果与免疫组化结果相符,MCD组和MCD+NaCl组相对于MCS对照组NOX4表达升高,而与MCD组和MCD+NaCl组相比,MCD+Ang(1-7)组NOX4表达相对较低,这些初步结果提示Ang(1-7)能够降低MCD诱导的NASH小鼠模型肝脏中NOX4、ASC、Caspase-1的表达;透射电镜观察结果提示,与MCS对照组相比,MCD诱导的NASH模型组小鼠肝血窦内皮细胞窗孔减少,内皮连续性增加,另外,线粒体明显肿胀、变形,而在MCD+Ang(1-7)组小鼠中内皮窗孔以及线粒体的变化比模型组有所改善。2、体外实验:AngⅡ作用于小鼠肝细胞AML12后能够使有活性的Caspase-1表达水平增加,作用时间在24h最为明显;而Ang(1-7)能够使有活性的Caspase-1表达水平降低,在24h最为明显。另外,AngⅡ能够使细胞总ROS增加,而同时给予Ang(1-7)刺激后,细胞ROS生成减少。结论:从第一部分相关结果可以看出,与MCD组和MCD+NaCl组相比,非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠腹腔持续注射Ang(1-7)后肝脏脂肪变及炎症程度较之有所改善。透射电镜超微结构显示Ang(1-7)能够抑制肝血窦内皮去窗孔化以及减轻线粒体肿胀、变形,提示Ang(1-7)能够改善肝血窦内皮细胞窗孔的去窗孔化,以及有维持线粒体形态和功能稳定的作用。另一方面,免疫组化和Western blot结果提示,Ang(1-7)能够降低NOX4、ASC、Caspase-1的表达,并且体外实验也提示Ang(1-7)能够降低细胞总ROS的生成。初步提示Ang(1-7)能够抑制NOX4的表达来减少ROS的生成,进而抑制NLRP3炎症小体的活化,最终抑制小鼠非酒精性脂肪性肝炎的进展。