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RNA干扰(RNAi)现象普遍存在于生物体细胞中，在理论上已清楚其分子机制，为蛋白质功能研究提供了新的方法。本研究设计合成了针对小鼠胚胎诱导型热休克蛋白70(Hsp72)基因的瞬时干扰siRNA，旨在通过RNAi技术干扰Hsp72基因的表达，以研究Hsp72基因沉默对小鼠早期胚胎发育的影响。试验通过RT-PCR和Westernblot检测Hsp72mRNA和Hsp72蛋白表达量，成功筛选出了对小鼠Hsp72基因具有显著抑制效果的siRNA，并借助LipofectamineTM2000转染小鼠4-细胞期胚胎，通过分析胚胎的囊胚发育率和孵出率，研究Hsp72在保护胚胎抗热应激方面的作用。
试验方法:
1.选择GenBank报道的小鼠Hsp72基因序列上的4个位点，体外化学合成4对siRNA，借助LipofectamineTM2000转染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。试验分为37℃对照组和热应激组，热应激组包括4个siRNA组，阳性对照组，阴性对照组及空白对照组。MEF在37℃、5％CO2、100％RH条件下预平衡的DMEM培养液中培养。热应激组MEF转染6h后更换为正常DMEM培养液，36h后在41℃、6％CO2条件下应激2h，之后通过RT-PCR和Westernblot检测细胞中Hsp72mRNA和Hsp72蛋白表达量，筛选出对小鼠Hsp72基因表达抑制效果显著的siRNA。
2.将最佳siRNA72瞬时转染4-细胞期小鼠胚胎。试验分为37℃对照组和热应激组，热应激组包括siRNA72组、阳性对照组、阴性对照组和空白对照组。胚胎在37℃、5％CO2、100％RH条件下预平衡的葡萄糖-CZB培养液中培养。热应激组胚胎转染6h后更换为正常葡萄糖-CZB培养液。胚胎发育到囊胚后，热应激组在41℃、6％CO2条件下热应激2h，之后通过RT-PCR和Westernblot检测Hsp72mRNA和Hsp72蛋白表达量。同时，siRNA转染4-细胞期胚胎后48h，统计各组胚胎由4-细胞发育到裘胚的数目，热应激48h后，统计各组胚胎的孵出囊胚数目（包括正在孵出和已经孵出的囊胚）。计算囊胚发育率和孵出率。
试验结果:
1.siRNA1、siRNA2两组及阳性、阴性和空白三个对照组的Hsp72mRNA和Hsp72蛋白表达量均极显著高于37℃对照组(P＜0.01)，siRNA3和siRNA4两组的Hsp72mRNA的表达量极显著低于37℃对照组(P＜0.01);siRNA3组Hsp72蛋白表达量极显著低于37℃对照组(P＜0.01)，而siRNA4组与37℃对照组差异不显著(P＞0.05)。与空白对照相比，siRNA3和siRNA4对MEF中Hsp72mRNA有极显著(P＜0.01)的抑制作用，其对Hsp72mRNA的抑制率分别为86.2％和75.4％，对Hsp72蛋白表达的抑制率分别为77.3％和57.0％。
2.阳性、阴性和空白三个对照组的Hsp72mRNA和Hsp72蛋白表达量显著高于37℃对照组(P＜0.01)，siRNA72组的Hsp72mRNA和Hsp72蛋白表达量显著低于37℃对照组(P＜0.01);同时显著低于siRNA阳性、阴性和空白三个对照组(P＜0.01)，而三个对照组之间差异不显著(P＞0.05)。与空白对照相比，siRNA72组对胚胎中Hsp72mRNA的抑制率为87.1％，对Hsp72蛋白表达的抑制率为78.5％。siRNA72组的囊胚发育率为41％，而空白对照组为86％，37℃对照组为84％;siRNA72组的囊胚孵出率为35％，而空白对照组为72％，37℃对照组为68％。