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背景和目的:新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)属副黏病毒科(Paramyxoviridae)腮腺炎病毒属(Paramyxovirus)成员,对禽类具有高度的致病性,在极少数情况下可以感染人类,表现为轻微的结膜炎或温和的呼吸道症状[1]。研究发现,NDV在人类肿瘤细胞中的复制效率是在正常细胞中的10 000倍[2],这使得人们将它作为潜在的抗癌生物制剂[3]。目前,NDV治疗肿瘤已经成为一种辅助及另类医疗方法(Complementary and alternative medicine, CAM)用于人类癌症的治疗,并已被广泛的研究[4]。本研究通过MTT法、HE染色法、电镜观察法、免疫组化法、流式细胞仪技术等实验方法,比较研究NDV D817株、NDV 7793株和NDV La Sota疫苗株体外对人喉癌Hep-2细胞及体内对人喉癌Hep-2细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制效应,同时将这3株NDV作用于人喉部正常组织细胞以对它们的安全性进行比较。材料和方法选取分离自香港的NDV D817株和江西鄱阳的NDV 7793株各1株及1株La Sota疫苗株,接种鸡胚以扩增病毒,48h后收取鸡胚尿囊液,测定血凝效价≥1:1024后,调整病毒浓度至1×108 PFU/ml,-80℃冰箱保存备用。常规方法培养非洲绿猴肾细胞Vero-E6、人喉癌Hep-2细胞和人喉部正常组织细胞。将3株NDV病毒接种人喉癌Hep-2细胞进行选择性扩增,并用Vero-E6细胞进行蚀斑纯化。得到纯化病毒后再次扩增,检测其HA效价,并用MTT法检测3株病毒对人喉癌Hep-2细胞及人喉部正常组织细胞的杀伤作用。将处于对数生长期的Hep-2细胞用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液消化,收集并调整细胞密度为5×107个/ml的细胞悬液备用。每只裸鼠取1个注射点,用上述细胞悬液0.2ml/只注射于裸鼠皮下,接种后每天观察有无肿瘤形成及注射点有无破溃红肿,当肿瘤长径和短径均达5mm后进行随机分组。通过醛化红细胞法收集尿囊液中的病毒颗粒,PBS稀释至1×107 PFU/ml作为NDV注射液,实验组每只裸鼠瘤内注射0.1ml。按规定时间测量肿瘤体积大小及裸鼠体重,绘制肿瘤生长曲线。NDV注射6周后处死裸鼠,秤量瘤块和脾脏重量,计算抑瘤率和脾脏指数,进行毒性评价。肿瘤组织用10%的福尔马林溶液固定,进行HE染色,评价移植瘤细胞在光学显微镜下的病理变化;通过电镜观察移植瘤细胞的病理变化;通过流式细胞仪检测移植瘤细胞的凋亡情况;通过免疫组化S-P两步法检测移植瘤中Bax和Bcl-2蛋白的表达情况。结果:本研究选用的3株NDV在体外均能在人喉癌Hep-2细胞中复制增殖,均能杀伤Hep-2细胞,而且杀伤效应与病毒的作用剂量及作用时间成正比。在采用MTT法检测3株NDV对人喉癌Hep-2细胞及人喉部正常组织细胞的杀伤作用实验中,3株NDV杀伤肿瘤细胞作用均较强。当病毒稀释度为1×10-1时,NDV作用细胞60h后NDV D817株、NDV 7793株和NDV La Sota株的杀伤率分别为96.65%、94.95%和95.35%;3株NDV对人喉部正常组织细胞影响相对较小(60h杀伤率≤25%),差异具有统计学意义。72h后3株NDV的杀伤作用均出现不同程度的下降现象。在纯化后病毒的蚀斑实验中,从3株NDV蚀斑出现的时间及PFU数量来看,NDV D817株出现蚀斑的时间最早,蚀斑数量最多,NDV 7793株出现蚀斑的时间最晚,蚀斑数量最少,NDV La Sota株居中。为了尽可能如实的评价3株NDV对肿瘤的抑制增殖作用,本研究Ⅱ期实验通过建立裸鼠移植瘤模型,从体内角度来研究3株NDV对人喉癌Hep-2细胞增殖的影响。裸鼠在接种Hep-2细胞后平均约4d后在接种部位可见瘤块生长,接种12d后肿瘤长径(L)和短径(W)均可达5mm,移植瘤成瘤率为100%。在治疗过程中,治疗初各组肿瘤体积为:PBS阴性对照组平均肿瘤体积为(183.5±15.2)mm3,NDV D817组平均肿瘤体积为(175.4±19.4)mm3,NDV 7793组平均肿瘤体积为(176.9±18.7)mm3,NDV La Sota组平均肿瘤体积为(185.4±20.4)mm3,顺铂阳性对照组平均肿瘤体积为(168.5±21.5)mm3,各实验组间肿瘤体积无显著性差异。治疗期间肿瘤体积逐渐增长,其中PBS阴性对照组增长速度最快,顺铂阳性对照组最慢,NDV组居中。治疗末,NDV组和顺铂阳性对照组肿瘤体积显著低于PBS阴性对照组(P<0.01)。治疗结束后剥取肿瘤组织称重, NDV D817组、NDV 7793组、NDV La Sota组和顺铂阳性对照组的抑瘤率分别为56.7%、51.2%、39.4%和90.4%。在裸鼠移植瘤治疗的毒性实验中,PBS阴性对照组和NDV实验组裸鼠体重治疗后较治疗前稍有下降,治疗后体重/治疗前体重>0.8,差别无统计学意义;顺铂阳性对照组裸鼠治疗后体重与治疗前相比有显著性降低(P<0.01),治疗后体重/治疗前体重<0.8,差别具有统计学意义,同时该组裸鼠随着治疗的进行活动力出现明显下降。在对荷瘤裸鼠脏器的影响方面,NDV实验组裸鼠的脾脏重量和脾脏指数与PBS阴性对照组相比,无显著性差异。顺铂阳性对照组的脾脏重量和脾脏指数显著低于PBS阴性对照组(P<0.01),差别具有统计学意义。取NDV实验组裸鼠肝脏切片观察,结果未发现有明显的病理变化。实验中通过对裸鼠肿瘤组织病理切片的观察,发现NDV D817组肿瘤组织与PBS阴性对照组相比有较多的死亡区域:细胞体积变小、变圆,与临近细胞脱离。高倍镜下可见细胞膜突起,呈发泡状,核膜裂解,核仁消失。与顺铂阳性对照组相比,细胞破碎现象不明显。流式细胞术分析检测显示,经NDV处理后,移植瘤细胞周期处于G0/G1期细胞含量降低,S期细胞数减少,而G2/M期细胞则增加(P<0.01),表明细胞周期被阻滞于G2/M期。免疫组化检测裸鼠皮下移植瘤细胞Bax、Bcl-2蛋白的表达情况,显示NDV 7793组和NDV La Sota组瘤细胞胞质棕黄色较PBS阴性对照组深,Bax蛋白表达率显著高于PBS阴性对照组,差别具有统计学意义(P<0.01)。NDV 7793组和NDV La Sota组Bcl-2蛋白的表达率与PBS阴性对照组相比,无显著性差异。结论:1、实验所选3株NDV具有选择性在人喉癌Hep-2细胞中复制增殖和杀伤癌细胞的作用,具备抗肿瘤生物治疗的潜能。其中NDV D817株具有较强的抗肿瘤效应,NDV 7793株和NDV La Sota株的抗肿瘤作用略低。2、3株NDV病毒株均对人喉癌Hep-2细胞裸鼠皮下移植瘤有明显的抑制作用。3、NDV D817株抗人喉癌的作用机制可能以细胞坏死途径为主;NDV 7793株和NDV La Sota株抗人喉癌的作用机制可能以细胞凋亡途径为主。