论文部分内容阅读
瑞氏木霉(Trichodermareesei)纤维二糖水解酶Ⅰ(cellobiohydrolaseⅠ)是目前研究的最为广泛的一种外切葡聚糖酶。其研究主要集中在两个方面，一方面是进一步阐释CBHI与结晶纤维素的作用机制，另一方面是对酶性质、特点、稳定性和催化活性等进行改造以满足生物工程应用的需要。CBHI在噬菌体展示系统中的展示，为进一步研究其作用机制和CBHI的定向进化提供了一个良好的研究平台。
本论文使用基因重组技术，分别构建了重组噬菌体表达质粒pCANTAB5E-cbh1及pCANTAB5E-cd，在噬菌体表面对纤维素外切酶CBHI全酶及其催化结构域(CD)进行了表达展示。
根据目的基因cbh1的cDNA序列设计两对引物，分别扩增cbh1全序列及其催化结构域序列cd，使之上游带SfiⅠ酶切位点，下游带NotⅠ酶切位点，以质粒pUCmT-cbh1为模板，进行PCR扩增反应，得到了长度分别为1.55kb和1.3kb的目的片段；将所得的DNA片段经NotⅠ和SfiⅠ双酶切后分别与噬菌粒载体pCANTAB5E进行连接，然后导入大肠杆菌TGI中，用Ampr筛选获得了阳性克隆，经双酶切鉴定，验证了构建的重组噬菌粒为pCANTAB5E-cbh1和pCANTAB5E-cd。
用帮助噬菌体M13K07侵染验证后的TGI转化子(pCANTAB5E-cbh1)，制备带有外源基因cbh1的重组噬菌体，酶联免疫吸附剂测定(ELISA)表明重组噬菌体对滤纸有明显的特异性吸附，说明展示后的CBHI的吸附特性没有改变。以pNPC为底物测定重组噬菌体的外切酶酶活，发现在重组噬菌体上表达的CBHI可水解pNPC底物，酶活为2.625×10-14IU/CBHI分子，证明展示后的CBHI催化特性没有改变。将带有外源基因cbh1的重组噬菌体侵染大肠杆菌HB2151，通过IPTG诱导表达出可溶性的外源蛋白CBHI。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，HB2151转导子与原始HB2151菌株所表达的蛋白在分子量为54kDa处出现明显差异条带，证明展示后的CBHI全酶大小与野生型一致。实验结果表明，瑞氏木霉纤维二糖水解酶Ⅰ在M13噬菌体展示系统中得到了完整的表达。