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瑞氏木霉(Trichodermareesei)纤维二糖水解酶Ⅰ(cellobiohydrolaseⅠ)是目前研究的最为广泛的一种外切葡聚糖酶。其研究主要集中在两个方面,一方面是进一步阐释CBHI与结晶纤维素的作用机制,另一方面是对酶性质、特点、稳定性和催化活性等进行改造以满足生物工程应用的需要。CBHI在噬菌体展示系统中的展示,为进一步研究其作用机制和CBHI的定向进化提供了一个良好的研究平台。
本论文使用基因重组技术,分别构建了重组噬菌体表达质粒pCANTAB5E-cbh1及pCANTAB5E-cd,在噬菌体表面对纤维素外切酶CBHI全酶及其催化结构域(CD)进行了表达展示。
根据目的基因cbh1的cDNA序列设计两对引物,分别扩增cbh1全序列及其催化结构域序列cd,使之上游带SfiⅠ酶切位点,下游带NotⅠ酶切位点,以质粒pUCmT-cbh1为模板,进行PCR扩增反应,得到了长度分别为1.55kb和1.3kb的目的片段;将所得的DNA片段经NotⅠ和SfiⅠ双酶切后分别与噬菌粒载体pCANTAB5E进行连接,然后导入大肠杆菌TGI中,用Ampr筛选获得了阳性克隆,经双酶切鉴定,验证了构建的重组噬菌粒为pCANTAB5E-cbh1和pCANTAB5E-cd。
用帮助噬菌体M13K07侵染验证后的TGI转化子(pCANTAB5E-cbh1),制备带有外源基因cbh1的重组噬菌体,酶联免疫吸附剂测定(ELISA)表明重组噬菌体对滤纸有明显的特异性吸附,说明展示后的CBHI的吸附特性没有改变。以pNPC为底物测定重组噬菌体的外切酶酶活,发现在重组噬菌体上表达的CBHI可水解pNPC底物,酶活为2.625×10-14IU/CBHI分子,证明展示后的CBHI催化特性没有改变。将带有外源基因cbh1的重组噬菌体侵染大肠杆菌HB2151,通过IPTG诱导表达出可溶性的外源蛋白CBHI。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,HB2151转导子与原始HB2151菌株所表达的蛋白在分子量为54kDa处出现明显差异条带,证明展示后的CBHI全酶大小与野生型一致。实验结果表明,瑞氏木霉纤维二糖水解酶Ⅰ在M13噬菌体展示系统中得到了完整的表达。