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第一部分:淫羊藿苷对股骨头微血管内皮细胞分泌外泌体的影响目的:糖皮质激素的应用可直接损伤骨微血管内皮细胞(bone microvascular endothelial cells/BMECs),从而促进非创伤性股骨头坏死和医源性骨质疏松的发生。而外泌体作为细胞间交流的载体,通过其携带的microRNA和蛋白在机体的正常生理功能和多种疾病的发生发展中起到重要作用。本研究旨在评估淫羊藿苷干预对激素引起的股骨头微血管内皮细胞损伤的作用,并探讨其对分泌的外泌体的影响。方法:选取因股骨颈骨折、髋关节骨关节炎或髋关节发育不良继发骨关节炎行全髋关节置换的病人,通过酶消法和免疫磁珠法从松质骨中分离微血管内皮细胞,应用免疫荧光法加以鉴定,氢化可的松(0.3mg/mL)及不同浓度的淫羊藿苷(0M,1×10-6M,1 × 10-5 M,5×10-5 M and 1×10-4M)进行干预,CCK-8法检测细胞活性。随后将细胞分为淫羊藿苷组和空白对照组,分别分离提取外泌体,应用纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)检测提取外泌体的直径和含量,通过BCA法检测蛋白质浓度,Western blot法检测外泌体携带的蛋白质的含量,高通量测序及qPCR检测microRNA水平。结果:分离的细胞表现为CD31和vWF高阳性率,光镜下表现为梭形或多边形,呈现鹅卵石样外观,表明分离的是骨微血管内皮细胞。淫羊藿苷能够减少激素对骨微血管内皮细胞增殖的抑制作用,在0M、1×10-6M、1×10-5M、5×10-5M和1×104M浓度的淫羊藿苷组中,细胞活性分别为 103.96%±2.15%、107.16%±1.28%、110.15%±1.01%、129.72%±0.86%和 131.87%±2.13%,组间差异具有统计学意义(F=207.467,p<0.001)。非干预组和淫羊藿苷处理组中外泌体的平均直径分别为(86.68±1.97)nm和(85.35±1.65)nm,蛋白浓度分别为(132.63±3.33)μg/mL和(138.56±9.58)μg/mL,差异均无统计学意义(p>0.05);两组外泌体浓度分别为(9.85±0.47)×106 个/mL 和(1.54±0.08)×107个/mL,差异有统计学意义(t=-10.191,p=0.001)。淫羊霍苷组中外泌体VEGFA/CD9和TGF-β1/CD9蛋白比值较空白对照组明显增加,差别有统计学意义(p<0.01),同时,淫羊藿苷干越还可上调或下调外泌体携带的多种microRNA(如miR-1469,miR-133a-5p和miR-10b-5p)的表达水平。结论:淫羊藿苷能够缓解激素引起的内皮细胞损伤,且具有剂量依赖性和剂量饱和性。淫羊藿苷虽不能改变骨微血管内皮细胞产生的外泌体的形态和大小,但可以明显增加外泌体数量。同时,淫羊藿苷不能改变外泌体中总蛋白含量,但能改变其蛋白组成,增加VEGFA和TGF-β1的含量。淫羊藿苷干预能够改变外泌体中多种与细胞增殖、迁移和凋亡有关的miRNA水平。第二部分:外泌体对激素诱导的股骨头微血管内皮细胞损伤和自噬的影响目的:研究内皮来源的外泌体对糖皮质激素引起的股骨头微血管内皮细胞(bone microvascular endothelial cells/BMECs)损伤和自噬的作用。以及淫羊藿苷预干预能否对外泌体是否会对这些作用产生影响。方法从行全髋关节置换术切取的股骨头中分离微血管内皮细胞,分为两组(空白对照组和淫羊藿苷干预组),分别提取外泌体。然后将提取的外泌体与骨微血管内皮细胞共培养,分别设为实验组和对照组;另一组未经外泌体干预的BMECs细胞设为空白对照组。CCK-8实验测定细胞活性,流式细胞法检测细胞凋亡,划痕实验检测细胞迁移,成管实验检测新生血管的生成,最后应用并Western blot测定与自噬、凋亡和增殖相关的蛋白表达。结果:空白对照组、对照组和实验组细胞凋亡率分别为35.67±1.99%、16.47±1.06%和10.70±0.7%,组间差异具有统计学意义(F=512.61,p<0.001);0.3mg/mL氢化可的松处理1、2、3、4天后,经过外泌体预处理的BMECs细胞活性明显高于空白对照组,且实验组细胞活性改变最为显著,差异具有统计学意义(p<0.01)。同时,血管外泌体干预可以增加BMECs内pERK、eNOS和COX-2等蛋白的水平,降低cleaved caspase-3和CDKN2C的表达水平。在空白对照组、对照组和实验组中,p62蛋白表达量呈递增趋势,LC3B-Ⅱ蛋白表达量呈递减趋势,各组间比较差异均有统计学意义(p<0.05)。激素处理12 h和24 h时,对照组和实验组细胞迁移能力明显高于空白对照组,实验组明显高于对照组,各组划痕闭合率比较差异均有统计学意义(p<0.05)。激素处理4、8 h时,实验组和对照组管腔数、出芽数和小管分支长度均显著大于空白对照组,差异有统计学意义(p<0.05);实验组小管分支长度和管腔数显著大于对照组(p<0.05),但出芽数与对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。结论:来自股骨头微血管内皮细胞的外泌体可以改善高浓度糖皮质激素诱导的骨微血管内皮细胞凋亡,降低低浓度糖皮质激素诱导的内皮细胞自噬,同时促进内皮细胞迁移和血管生成。淫羊藿苷预处理可以加强外泌体的这些作用,有希望用于治疗糖皮质激素诱导的相关骨病。第三部分:体外震波对激素性股骨头坏死患者骨微血管内皮细胞microRNA表达的影响目的:骨微血管内皮细胞(BMECs)的损伤和凋亡参与了激素性股骨头坏死(ONFH)的发生,体外震波作为一种无创技术,能够改善骨坏死的预后。本实验试图研究体外震波对激素性股骨头坏死患者骨微血管内皮细胞microRNA表达的影响。方法:从激素性ONFH患者切除的股骨头内分离微血管内皮细胞,然后将第3代细胞分为震波组和对照组:在前一组中,这些细胞暴露于聚焦式冲击波(0.11 mJ/mm2,400次),而后一组细胞未经冲击波干预。在处理后24小时,使用Illumina HiSeq2500平台分析两组细胞microRNA(miRNA)表达谱,寻找差异表达miRNA,预测和评估差异表达miRNA涉及的信号传导途径和靶基因。结果:本次调查纳入了3名患者,来自同一个体的细胞分别分为实验组1(T1)和对照组1(C1),实验组2(T2)和对照组2(C2)以及实验组3(T3)和对照组3(C3)。153个miRNA在T1和C1组之间的比较中显示差异表达,218个miRNA在T2和C2组之间的比较中显示差异表达,同时135个miRNA在T3和C3组之间的比较中显示差异表达。结合这些数据,在震波治疗后,在多个成对比较中鉴定了骨微血管内皮细胞中共54种差异表达的miRNA(41种上调的miRNA和13种下调的miRNA),其中13种miRNA既往被报道参与内皮细胞的功能调节。在所有三个配对比较中,仅确认其中一个miRNA被上调。结论:体外震波诱导的骨微血管内皮细胞内miRNA的变化对于其在激素性股骨头坏死的治疗中可能起到一定的保护作用,但不同个体之间差异较大,震波治疗干预股骨头微血管内皮细胞的机制仍有待确定。