肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，每年有600,000新发病例，并且超过50%的新发病例和死亡发生在中国。近年来，虽然肝癌的外科治疗取得了一定的突破，但是能够进行手术切除的早期病例仅仅15%，其他的非手术治疗疗效也始终不能令人满意。随着三维适形和调强放疗技术的临床应用，有效的保护了正常肝脏和临近的器官，为肝癌的放射治疗开创了新的局面。但是放射治疗也存在一定的局限性，特别是对一些中晚期、复发性肿瘤的放疗的疗效很差，其主要原因是肿瘤细胞对放射线的抵抗作用。细胞受到放射线照射后，DNA分子主要产生碱基损伤和DNA链断裂，并主要通过体内的碱基切除修复（base excision repair, BER）和DNA双链断裂修复途经（DNAdouble-strand-breakrepair, DDSBR）修复受损的DNA，以维持基因组的稳定性。然而对于肿瘤细胞而言，DNA损伤与修复则是肿瘤细胞对放射线抵抗或不敏感重要机制之一。脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrimidinic endonuclease，APE1)是BER途径的关键限速酶，是细胞放射性损伤和烷化剂致伤重要的修复因子。此外，APE1还具有氧化还原功能（reduction-oxidation, redox），通过维持细胞内多种转录因子的激活还原态，而参与多种关键的细胞反应，如氧化应激，转录因子调节，细胞周期控制与凋亡。APE1可通过氧化还原机制调节多种转录因子的DNA结合活性，进而调节下游靶基因表达，参与肿瘤放化疗抵抗。研究报道受APE1调控的转录因子有p53, NF-κB, HIF-α,Fos/Jun(AP-1), PAX-8, ATF/CREB家族等。而肝癌中p53的突变率高达60～70%。我们前期的研究显示肝癌组织中APE1和mtp53蛋白两者共表达密切相关，动物实验结果显示APE1siRNA质粒+Ad5-wtp53+放疗联合组生长抑制率显著高于Ad5-wtp53（Genecine）+放疗组，提示APE1和mtp53之间可能存在着调节作用，两者相互协同进而共同决定肝癌的放疗抵抗。过去的研究表明，APE1可以通过氧化还原依赖和非依赖机制激活野生型p53，而这种调节作用依赖于p53C端调节域(CRD)。由于肝癌中p53基因的突变主要是结构性突变，对p53C端调节域没有影响，因此APE1很可能对mtp53具有同样激活作用。本研究以人体肝癌为研究对象，旨在探讨APE1对mtp53的调节作用及其可能机制，为进一步阐明肝癌放疗抵抗的分子机制，以及今后对不同基因状态的肝癌患者施行个体化的基因治疗提供了理论和实验基础。研究目的1.体外观察证实mtp53具有”功能获得”的癌基因作用,并与肝癌的放疗敏感性密切相关；2.体外探讨敲低APE1增强p53突变的肝癌细胞株放射治疗敏感性；3.同时以肝癌中249密码子突变蛋白R249S为切入点,进一步证实APE1对mtp53具有激活作用以及相关分子的机制；4.体内探讨敲低APE1对放射治疗p53突变的肝癌细胞裸鼠移植瘤的协同作用。研究内容和方法1. mtp53癌基因特性及其与肝癌放疗敏感性的关系：选择p53不同状态的肝癌细胞株，以及转染pCMV-mtp53R249S于p53缺陷的细胞Hep3B中，检测放疗敏感性，以确定mtp53癌基因功能及其在放疗抵抗中的作用。2. APE1对mtp53R249S的调节作用：应用p53（-/-）肝癌细胞Hep3B、p53野生肝癌细胞HepG2以及p53突变（R249S）肝癌细胞MHCC97L，分别转染APE1siRNA腺病毒（Ad5/F35-APE1siRNA）抑制APE1的表达，观察其对肝癌细胞放疗敏感性的影响；同时，Western Blot和qRT-PCR检测APE1和mtp53表达，以及P53下游基因P21蛋白和mRNA表达的变化。3. APE1对mtp53R249S作用的机制研究：以p53下游靶基因P21启动子中的P53结合序列为对象，分别合成线性（P53RE--Line）和干环结构（p53RE-structure）DNA，应用EMSA方法，检测APE1对非还原型（未经DTT处理）和还原型（DTT处理）的mtp53R249S蛋白与P53RE-Iine和p53RE-structure的结合能力，进而显示APE1对mtp53R249S与DNA结合的选择属性（线性的，或结构性的）、依赖途径（redox依赖，或redox非依赖）；应用p53抗体和APE1抗体进行染色质共沉淀（ChIP），Q-PCR方法检测p21基因DNA，探讨APE1对mtp53R249S的激活作用。4. APE1对p53突变肝癌细胞移植瘤放射治疗敏感性的影响：建立p53突变的肝癌细胞裸鼠移植瘤模型，观察Ad5/F35-APE1siRNA联合放射治疗对移植瘤生长抑制的协同作用，测量移植瘤的大小，绘制肿瘤生长曲线，并应用Ki-67免疫组化染色和TUNEL法分别检测肿瘤细胞增殖和凋亡。研究结果1. mtp53癌基因特性及其与肝癌放疗敏感性的关系。不同p53状态的肝癌细胞株HepG2(wtp53)、Hep3B (p53-/-)和MHCC97L (mtp53,R249S)经不同剂量X射线照射后，用MTT检测肝癌细胞存活情况，克隆形成实验检测肝癌细胞克隆形成，以及流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡。随着照射剂量的增加，肝癌细胞存活率和克隆形成率逐渐降低，同时肝癌细胞凋亡率逐渐增加；但在相同剂量射线照射后，MHCC97L的细胞存活率和克隆形成率都高于HepG2和Hep3B细胞，且MHCC97L的细胞凋亡率低于HepG2和Hep3B细胞，表明在相同放射剂量的照射下，MHCC97L细胞株对放射线最为抗拒；并且，在相同剂量下，Hep3B的细胞存活率和克隆形成率高于HepG2，且其凋亡率比HepG2细胞低，表明p53缺失的肝癌细胞株Hep3B比野生型p53的肝癌细胞HepG2对放射线更加抵抗。因此，不同p53状态肝癌细胞株对放射治疗敏感性为：HepG2>Hep3B>MHCC97L。在p53缺失的Hep3B肝癌细胞株中分别转染pCMV-wtp53和pCMV-mtp53质粒，经不同剂量X射线照射后，观察其对放射治疗敏感性。随着X射线照射剂量的增加，肝癌细胞存活率和克隆形成率逐渐降低，而细胞凋亡率逐渐增加；在相同剂量照射后，细胞存活率和克隆形成率为，pCMV-mtp53组>未转染组>pCMV-wtp53；同时细胞凋亡率为pCMV-wtp53组>未转染组> pCMV-mtp53；表明在相同放射剂量的照射下，转染了pCMV-mtp53的Hep3B细胞株对放射线最抗拒，然而转染了pCMV-wtp53的Hep3B细胞株对放射线最敏感，提示mtp53与肝癌细胞的放疗抵抗相关。2. APE1对mtp53R249S的调节作用。Ad5/F35-APE1siRNA感染肝癌细胞株HepG2、Hep3B和MHCC97L，以Ad5/F35-EGFP感染为对照；分别用不同剂量X射线照射后，检测其对放射治疗的敏感性。我们发现随着照射剂量的增加，Ad5/F35-APE1siRNA组和Ad5/F35-EGFP组肝癌细胞存活率、克隆形成逐渐减低，同时凋亡率逐渐增加；在相同剂量照射下，与Ad5/F35-EGFP组相比，Ad5/F35-APE1siRNA组肝癌细胞存活率和克隆形成率均明显降低，而凋亡率明显升高。随着X射线照射剂量的增加，MHCC97L细胞APE1蛋白表达水平也增加；在6GyX射线照射后APE1蛋白水平达到最大值。我们进一步用Ad5/F35-APE1siRNA腺病毒分别感染HepG2和MHCC97L细胞，经6Gy X射线照射后，用Western Blot检测APE1、P53和P21蛋白表达情况。X射线能够诱导肝癌细胞APE1蛋白表达增加，Ad5/F35-APE1siRNA有效敲低APE1蛋白表达并且抑制射线诱导的APE1表达；在HepG2细胞中，敲低APE1也能够抑制射线诱导的WTP53和P21蛋白表达增加；而在MHCC97L细胞中，虽然敲低APE1也抑制了射线诱导的MTP53蛋白表达，但在MHCC97L细胞各处理组中均未检测到P21蛋白表达。3. APE1对mtp53R249S作用的机制研究。P53的作用是通过与DNA的结合来实现的，我们选用p53下游基因p21中p53结合序列，分别合成了线性DNA序列和干环状结构序列，应用EMSA检测非还原型（未经DTT处理）和还原型（DTT处理）wtp53蛋白和mtp53蛋白对线性和干环状DNA的结合能力。研究显示还原型wtp53具有与线性和干环状DNA结合的能力；而还原型mtp53蛋白R249S仅具有对干环状结构DNA的结合能力。分别在HepG2和MHCC97L细胞株转染WTAPE1或Ad5/F35-APE1siRNA，应用EMSA检测显示APE1能够促进还原型wtp53与线性和干环状DNA的结合，并且能够增强还原型mtp53R249S与干环状DNA的结合能力。以p53作用的下游基因p21为检测p53激活对象，从染色质结合水平研究APE1对p53结合DNA的活性作用。WTAPE1增强wtp53肝癌细胞株p21DNA结合水平和p21mRNA和蛋白水平；而敲低APE1抑制p21DNA结合水平和p21mRNA和蛋白水平。WTAPE1增强mtp53肝癌细胞株p21DNA结合水平,但是并不能诱导p21mRNA和蛋白表达；同样，敲低APE1降低了mtp53肝癌细胞株p21DNA结合水平,也并未改变p21mRNA表达。研究结果提示在mtp53肝癌细胞株中，APE1可能通过激活了p53下游的其他基因，从而协同mtp53蛋白的癌基因作用。4.敲低APE1提高肝癌放疗敏感性动物实验研究。在HepG2和MHCC97L裸鼠移植瘤中，Ad5/F35-APE1siRNA+IR联合组的抑瘤率和肿瘤细胞凋亡率显著高于其他治疗组；Ad5/F35-APE1siRNA治疗组与IR治疗组比较抑瘤率和细胞凋亡率均无显著差异，但均强于对照组。Ki-67免疫组化显示，Ad5/F35-APE1siRNA+IR组细胞增殖率明显低于对照组和其他治疗组；Ad5/F35-APE1siRNA治疗组和IR治疗组细胞增殖率均明显低于与对照组，而Ad5/F35-APE1siRNA治疗组与IR治疗组细胞增殖率没有显著差异。结论1.不同p53状态的肝癌细胞株对放射治疗敏感性不同，HepG2最强，Hep3B次之，MHCC97L最弱；且pCMV-mtp53转染p53缺失的肝癌细胞株后，其对放疗最为抵抗，提示mtp53与肝癌细胞的放疗抵抗相关。2. Ad5/F35-APE1siRNA能够增强p53突变肝癌细胞株的对放射治疗敏感性；APE1可能通过与Mtp53蛋白相互作用，激活了Mtp53下游的其他基因，而不是p21基因，发挥其在肝癌放射治疗抵抗中的协同作用。3. Mtp53可能通过“结构选择模式”与干环状DNA结合；APE1通过激活还原型mtp53与干环状DNA序列结合。4. Ad5/F35-APE1siRNA能够增强肝癌细胞裸鼠移植瘤对放射治疗敏感性，为以APE1为靶点的基因治疗联合放射治疗提供理论和实验基础。