论文部分内容阅读
目的:观察SDS和NaOH复合消蚀法制备的胎儿无细胞真皮基质(acellulardermalmatrix,ADM)的组织相容性,以及VEGF165对ADM的血管化的影响。为进一步改良真皮支架提供实验依据。
方法:采用足月胎儿皮肤,将皮肤切成4×5cm,经1M高渗NaCl溶液浸泡24小时,除去表皮,再先后用0.5%SDS和4%NaOH溶液各消蚀10个小时,其间用超声波清洗仪间断振荡以除去细胞碎片,制成ADM。取ADM,常规脱水,石蜡包埋及切片,HE染色,观察ADM的一般结构和细胞成分的残留情况。取2×2cm制备好的ADM,用冰冻切片机将其制成厚约为300μm放入溶有青霉素的PBS中4℃保存待用。选用重约300克的SD雄性大鼠45只,随机分为ADM包埋组、ADM加rAAV/LacZ组和ADM加rAAV/VEGF165组,每组15只。采用背部切口,切口大小为2.5×2.5cm。分别将ADM或ADM+rAAV/LacZ或ADM+rAAV/VEGF165包埋于真皮和皮肌之间,然后缝合、包扎。术后2,4,6周分别取材,每组5只。所取标本用Bouin液固定,脱水,包埋,切片后作如下处理:1.HE染色;2.以VEGF165,MMP-1,TIMP-1的单克隆抗体进行免疫组织化学染色,检测三种蛋白质在移植后的皮肤中的表达情况。观察并比较各组中ADM血管密度。进行图象处理和统计学分析。通过以上的观察分析,比较不同组之间血管化情况和愈合情况。
结果:1.经SDS和NaOH各10小时消蚀后的ADM从外观和物理性能上看,韧性较好,同时质地较柔软,具有一定的抗张力作用。经组织切片HE染色后发现,此时ADM组织中无细胞成分,其结构主要为嗜酸性的胶原成分。2.ADM皮下包埋实验各实验组的大鼠在术后伤口均未见不良反应,愈合良好,缝口处有轻微的瘢痕形成,取材时观察,包埋于皮下的ADM与真皮已愈着。3.术后2周观察包埋ADM组织中有少量的细胞成分出现,可见到早期新生毛细血管,及VEGF阳性细胞。此时ADM临近组织中MMP-1和TIMP-1均明显表达,而且MMP-1高于TIMP-1,显示ADM血管化已开始,MMP-1与ADM血管化进程相关。4.术后4周,ADM空白组和rAAV/LacZ对照组的ADM中,细胞数量和新生血管均高于2周。此时各组中ADM及临近组织中MMP-1的表达高于TIMP-1,但TIMP-1的表达较2周时有所增强。提示此时血管化过程中细胞迁移相对降低,新生血管的再塑有所加强。5.术后6周,各组ADM中的细胞数、新生血管的密度与4周时相比无明显变化。rAAV/VEGF165实验组中VEGF阳性细胞和血管密度明显高于ADM空白组和rAAV/LacZ对照组(P<0.05),提示实验组中外源性VEGF已导入宿主细胞,并开始表达并发挥生物学作用。而载体(rAAV/LacZ)本身对ADM的血管化无明显影响。此时TIMP-1的表达则高于MMP-1,预示ADM中新生血管的再塑加强及趋向成熟。
结论:1.SDS和NaOH复合消蚀法所制成的ADM去除细胞彻底,并保持了真皮中原有细胞外基质构筑的形态学完整,而且免疫原性低,组织相容好。2.VEGF165与ADM复合移植,具有促进ADM血管化作用。3.MMP-1和TIMP-1的相互作用参与植入体内的ADM的血管化过程。