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目的:冷冻消融作为前列腺癌的重要治疗手段,在杀伤肿瘤细胞的同时,可诱发机体抗肿瘤免疫反应。大量证据显示,冷冻消融后机体内尚存在抑制性因素(免疫细胞和免疫因子)制约抗肿瘤免疫反应效果,有必要进一步探讨抑制性免疫细胞(如调节性T细胞、髓源抑制细胞)和免疫因子(TGF-β、IL-10)在此过程中的作用机制。我们前期工作发现,前列腺癌患者冷冻消融治疗后外周血和肿瘤组织中转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)水平明显增加。文献研究表明,TGF-β可通过招募髓源抑制细胞(myeloid derived suppressor cells,MDSC)、调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)等免疫抑制细胞,促进肿瘤细胞的免疫逃逸,且MDSC、Treg等可分泌TGF-β、IL-10等负性调节因子,进一步增强其免疫抑制功能。课题组前期研究已初步证实冷冻消融联合TGF-β阻断治疗前列腺癌可以减少机体MDSC细胞数量,其具体机制有待进一步探明。据此,本研究重点分析冷冻消融联合TGF-β阻断对MDSC细胞功能的影响,并探讨其相关机制,以期为解除冷冻免疫过程中的抑制性因素和提高冷冻消融为主的综合疗效提供实验基础和理论依据。方法:1.收集前列腺癌患者外周血,采用流式细胞术检测外周血中MDSC及Treg细胞比例,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测外周血中TGF-β的表达水平,运用统计软件分析前列腺癌患者外周血中TGF-β水平、MDSC和Treg三者的相关性;同时,采用组织芯片技术检测前列腺癌组织中TGF-β、CD11b(CD11b阳性的单核细胞代表MDSC)及FOXP3(FOXP3阳性的T细胞代表Treg)的表达,并分析其相关性。2.构建RM-1前列腺癌荷瘤小鼠模型,利用磁珠分选方法从荷瘤小鼠脾脏中分选出MDSC细胞,将MDSC细胞与RM-1细胞共培养,体外模拟冷冻消融微环境,分别给予如下实验处理:A组不作任何处理(对照组),B组加入TGF-β单抗(单抗组),C组加入RM-1冷冻坏死液(冷冻组),D组同时加入RM-1冷冻坏死液和TGF-β单抗(联合组)。共培养24h和48h后分别收集细胞上清,ELISA检测各组共培养上清中TGF-β及IL-10的表达水平;同时收集MDSC细胞,流式细胞术检测MDSC细胞向M1型(CD11b、F4/80、CD16/32、CD86)和M2型(CD11b、F4/80、CD206)巨噬细胞的分化趋势;同时利用Transwell系统检测MDSC细胞趋化能力。3.磁珠分选正常小鼠脾脏CD4~+T细胞,将其与前列腺癌来源的MDSC细胞共培养,分组处理同前,共培养24h和48h后,收集MDSC细胞,Western Blot和RT-PCR检测MDSC细胞免疫抑制蛋白Arg-1、iNOS的表达水平;同时收集CD4~+T细胞,流式细胞术检测Th1/Th2的比例。4.利用平板克隆实验、MTT以及Transwell实验检测RM-1细胞与MDSC细胞的共培养上清对RM-1细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:1.前列腺癌患者外周血中TGF-β表达水平与MDSC数量、Treg数量分别呈正相关(r=0.6710,P=0.0012;r=0.6906,P=0.0007),Treg数量与MDSC数量亦呈正相关(r=0.9418,P<0.0001)。2.前列腺癌组织中MDSC、Treg及TGF-β的表达水平明显高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.0001);相关性分析显示前列腺癌组织中TGF-β表达水平与MDSC、Treg表达水平分别呈正相关(r=0.6729,P<0.0001;r=0.6729,P<0.0001),Treg表达水平与MDSC表达水平亦呈正相关(r=0.3140,P=0.0026)。3.MDSC与RM-1共培养24h后,联合组上清中TGF-β表达水平较对照组及冷冻组明显减低(P<0.001,P=0.009),而与单抗组比较无统计学差异(P=0.780);共培养24h后联合组上清中IL-10表达水平较对照组及单抗组明显减低(P=0.001,P=0.027),而与冷冻组比较无统计学差异(P=0.247);共培养48h后联合组上清中TGF-β、IL-10表达水平较其他三组均明显减低(P<0.05)。4.MDSC与RM-1共培养24h、48h后,联合组中MDSC向M1型巨噬细胞分化的趋势较其他三组更为显著(P<0.05),且M1/M2比例明显高于其他三组(P<0.05);其余三组两两比较均无统计学差异(P>0.05);与对照组比较,冷冻组、单抗组和联合组MDSC细胞趋化能力均明显减弱(P<0.05);且联合组MDSC趋化能力低于冷冻组和单抗组(P<0.05),冷冻组与单抗组比较无明显差异(P>0.05)。5.MDSC与CD4~+T共培养24h、48h后,联合组中MDSC表达的Arg-1及iNOS均较其他三组明显减低(P<0.05);MDSC与CD4~+T细胞共培养24h后,联合组Th1/Th2比例明显高于对照组及单抗组(P<0.001),而与冷冻组比较无统计学差异,冷冻组Th1/Th2比例明显高于对照组(P=0.042),而与单抗组比较无统计学意义;共培养48h后,联合组Th1/Th2比例明显高于其他三组(P<0.05),冷冻组Th1/Th2比例明显高于对照组及单抗组(P<0.05);而单抗组Th1/Th2比例在共培养后24h和48h与对照组比较均无统计学意义(P>0.05)。6.RM-1细胞与MDSC细胞共培养后,在联合组共培养上清中RM-1细胞的增殖、迁移及侵袭能力较其他三组共培养上清明显减弱(P<0.05)。结论:1.前列腺癌患者外周血及肿瘤组织中TGF-β、MDSC及Treg三者之间密切相关,提示TGF-β与肿瘤微环境中免疫抑制细胞关系密切,可能通过影响MDSC和Treg细胞发挥免疫抑制作用。2.冷冻消融联合TGF-β单抗阻断可减少免疫抑制因子TGF-β和IL-10的水平,并促进MDSC向M1型巨噬细胞的优势分化,减弱MDSC介导的免疫抑制作用和MDSC细胞的趋化能力,进而减弱肿瘤微环境中MDSC的免疫抑制作用。3.冷冻消融联合TGF-β单抗阻断可下调MDSC中Arg-1、iNOS的表达,并促进CD4~+T细胞向Th1型优势转化,有助于增强CD4~+T细胞发挥抗肿瘤效应。4.冷冻消融联合TGF-β单抗阻断处理后,肿瘤微环境中的RM-1细胞增殖、迁移及侵袭能力明显减弱,可有助于控制肿瘤生长。