研究背景:糖皮质激素(GC)耐药是临床急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗中常见的难题,也是导致治疗失败的主要原因之一。GC耐药机制复杂,目前为止尚未明确,GR作为GC的直接作用分子成为GC耐药的研究热点。GR基因编码区的单核苷酸多态性(SNP)位点在多种疾病中均与GC敏感性相关,同时体外实验研究表明在白血病细胞株中GR基因5’及3’端的转录子差异表达与GC敏感性相关。但针对GR基因非编码区SNP位点与儿童ALL糖皮质激素敏感性研究较少,另外在儿童ALL原代细胞中GR基因5’及3’端的转录子差异表达是否与GC敏感性相关。本研究试图探讨上述问题,本课题的完成将进一步揭示GC抵抗的分子机制,可能为GC的个体化治疗提供科学依据。研究一:GR基因多态性与儿童急性淋巴细胞白血病体内糖皮质激素反应的相关性研究目的:探讨GR基因单核苷酸多态性(包括编码区和非编码区)及其构成的单倍型与儿童急性淋巴细胞白血病体内糖皮质激素反应的相关性。方法:1.以63例儿童ALL患者和33例同龄健康儿童为研究对象。ALL患儿依据治疗最初一周强的松窗口试验结果分为反应良好组(PGR)及反应不良组(PPR)。采用病例对照研究的方法,研究GR基因多态性与中国汉族人群儿童ALL患者体内GC反应的相关性。本研究共选择5个SNP位点(rs7701443、rs10052957、rs41423247、rs6189/6190和rs6198)。2.争得家属及患儿本人同意,签署知情同意书,采集标本,初诊ALL儿童采集骨髓1ml,健康体检儿童标本收集体检剩余的血样(外周血200ul),进行基因组DNA提取,运用普通PCR及基因测序技术检测SNP位点的基因型。3.应用SPSS16.0软件进行统计分析,应用拟合优度χ2检验SNP位点基因型分布频率是否符合哈迪-温伯格遗传平衡定律,采用χ2检验法比较两组间等位基因频率、基因型频率的分布差异,并用Logistic回归做相关分析,应用SHEsis软件进行单倍型分析,检验水准α=0.05。结果:1.所研究的5个SNP位点在本研究人群中出现的频率GR基因非编码区的3个SNP位点(rs7701443,rs10052957,rs41423247)在本研究人群中均存在多态性,三者在病例组MAF分别为0.404、0.103、0.246,对照组MAF分别为0.454、0.09、0.287,基因型分布频率符合哈-温平衡。其余两个位点在病例组及对照组中均未检测到多态性。2.多态性位点rs41423247、rs7701443及rs10052957与儿童ALL体内强的松反应的相关性位点rs41423247在PGR及PPR两组间等位基因频率的分布差异具统计学意义,odds ratio(OR)=9.58,95%可信区间(CI):1.23-74.21,P=0.01;两组间基因型频率的分布无明显差异(P>0.05);合并CG+GG基因型,与CC基因型相比,两组间分布差异具统计学意义,OR=9.778,95%CI:1.174-81.433,P=0.032。位点rs7701443在PGR及PPR两组间等位基因频率的分布差异具统计学意义,OR=3.12,95%CI:1.08-9,P=0.029;两组基因型频率分布差异无统计学意义。位点rs10052957等位基因及基因型频率在两组间的分布无明显差异(P>0.05)。3.单倍型(rs7701443、rs10052957、rs41423247三个位点构成)与儿童ALL体内强的松反应的相关性由上述3个SNP位点构成的频率大于3%的单倍型共有4个,分别为CCC、TCG、TCC和TTG。单倍型CCC在PPR组的分布频率明显高于PGR组(P=0.013);而单倍型TCG在PGR组的分布频率明显高于PPR组(P=0.028)。结论:GR基因非编码区单核苷酸多态性位点(rs7701443、rs41423247)及其所构建的单倍型可能与中国东北地区汉族人群儿童急性淋巴细胞白血病体内强的松反应相关。研究二:GR基因转录子与儿童ALL原代细胞体外GC抵抗的相关性研究目的:探讨GR基因5’及3’端转录子的差异表达与儿童ALL原代细胞体外对GC抵抗的相关性。方法:1.以初次确诊为急性淋巴细胞白血病患者为研究对象,在争得家属及患儿本人同意及签署知情同意书的前提下,采集骨髓标本1ml用于后续研究。2.儿童ALL原代细胞进行体外培养(96孔板),体外给予prednisolone进行细胞毒试验,应用CCK-8法检测细胞增殖情况并计算IC50值,依据IC50值分为GC敏感组和耐药组(每组9个样本)。3.另一部分原代白血病细胞进行体外培养(24孔板),同样给予prednisolone干预,分别在干预的H0、H3、H8、H24四个时间点收集细胞,提取总RNA,逆转录成c DNA,然后应用实时定量PCR的方法对GR基因5’及3’端转录子(1A、1B、1C、GRα、GRβ)进行相对定量检测。4.应用SPSS16.0软件进行统计分析,采用均值±标准差形式表示数据,两组均数比较采用t检验,多组均数比较用方差分析,组间比较采用S-N-K法。结果:1.GC体外诱导ALL原代细胞GR-1A、1B、1C转录子表达变化与GC抵抗的相关性。体外给予prednisolone作用后,GC敏感组和GC耐药组外显子1A、1B、1C均表达上调,H24时间点上调水平最明显(P<0.001)。以H24时间点表达量为研究对象,GC敏感组与耐药组相比外显子1A、1B、1C的表达上调幅度无明显差异(P>0.05)。且GC敏感组及耐药组1A、1B、1C的差异表达无统计学意义(P>0.05)。2.GC体外诱导儿童ALL原代细胞GRα、GRβ转录子的表达变化与GC抵抗的相关性。体外给予prednisolone作用后,GC敏感组和GC耐药组GRα、GRβm RNA表达均上调,H24时间点上调水平最明显(P<0.001)。以H24时间点表达量为研究对象,GC敏感组GRαm RNA表达上调幅度明显高于GC耐药组(P=0.026),GRβm RNA的表达变化在两组间无明显差异(P>0.05)。且GC敏感组及耐药组GRα的表达明显高于GRβ(P<0.05)。结论:GC在体外可诱导儿童ALL原代细胞GR基因转录子1A、1B、1C、GRα、GRβm RNA表达上调,GC诱导GRα的上调幅度可能与GC敏感性相关。