细胞适配体筛选可概括为前期准备、PCR扩增、次级文库制备和筛选四个部分,本文以这四个内容为导向,对CELL-SELEX技术筛选细胞适配体方法学进行了深入研究。本文首次以人胰腺癌细胞PANC-1为靶细胞进行适配体筛选研究。在对照细胞选择上引入了一种新的对照细胞选择策略,并确定了A549细胞为对照细胞的反向筛选。细胞状态稳定对适配体筛选非常重要,本文通过高传代频率的培养策略来维持细胞在整个筛选过程中状态稳定。结合软件与PCR扩增协同分析,对引物序列、PCR扩增效率和抗干扰性进行考察,确定了本文所用引物在细胞适配体筛选中的适用性。PCR在CELL-SELEX中被广范用于扩增次级文库。随机文库为模板的PCR难度大,不确定因素多。本文采用多种PCR方法对随机文库PCR特点进行考察。发现退火温度调节对扩增效率影响明显,对非特异性扩增作用较小;随机文库PCR对程序循环数极其敏感,循环数远少于常规PCR,对扩增效率和选择性影响较大。在次级文库PCR方法优化中,总结出一套具有广泛适用性的PCR优化策略,对细胞适配体筛选次级文库PCR具有指导意义。在次级文库制备中,针对单链分离过程建立了相应的监控办法,可对过程及时反馈,并确定待回收样品。通过延长PCR产物与Streptavidin-Agarose孵育时间,提高了分离柱对PCR产物的固载效率。借助核酸助沉剂(Acryl carrier),建立了适用于适配体筛选ssDNA乙醇低温沉淀回收方法,可以选择性回收目的ssDAN,回收率在80.0%以上。同时解决了ssDNA脱盐、PH平衡和ssDNA浓缩的问题。并建立了相应的定量表征方法。筛选是CELL-SELEX的主要内容,本文对细胞适配体筛选与筛选强度调整方法进行了研究。确定了5种基本筛选强度调整方式(细胞数量、ssDNA孵育浓度、孵育时间、孵育摇床转速和孵育后洗涤),发现5种调整方式之间的协同关系,确定了细胞量与文库孵育浓度在筛选强度调节中的基础地位,以及孵育后洗涤条件中洗涤时间在洗涤强度中的决定性作用。通过本次细胞适配体方法学研究成功搭建了PANC-1细胞适配体筛选平台,并初步筛得了PANC-1高亲和的候选适配体群。