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冬虫夏草是我国传统的珍稀中药,具有补肺益肾、止血、化痰、抗炎症、抗癌以及调节血脂代谢等多种生物学活性。由于天然冬虫夏草资源匮乏,使得其代用品的开发和利用成了必然趋势。从天然虫草的虫体中分离出寄生真菌并对其进行人工培养,最终获得的菌丝体等产物可以作为冬虫夏草的替代品,这种方式己成为近年来开发利用替代品的常规手段。蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)是从天然冬虫夏草中分离得到的真菌,再通过人工发酵培养获得菌丝体,作为冬虫夏草的替代品已在中成药和保健食品中使用。大量研究表明蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体具有降血脂的功效。实验室前期研究发现菌丝体甲醇提取物(methanol extract from mycelia of Paecilomyces hepiali,PHME)可明显抑制前脂肪细胞分化,抑制脂肪细胞的脂肪形成,提示PHME可能具有干预脂肪积累的作用,但其对影响脂肪细胞脂质积累的另一重要方面——脂肪分解的影响尚不可知。肝脏脂质代谢异常,甘油三酯在其中过量累积,引发肝细胞脂肪变性,可进一步加剧脂代谢紊乱。PHME是否能干预肝脏脂肪积累,改善肝细胞的脂肪变性仍不明确。为此本研究采用脂肪细胞和肝细胞模型,系统评价了 PHME对脂肪细胞脂肪分解及对油酸纳诱导的肝细胞脂肪积累的影响,并进一步探讨其作用机制,旨在为蝙蝠蛾拟青霉的功能开发和应用提供实验依据。此外,对PHME中主要活性成分虫草素对脂肪细胞和肝细胞的脂质积累的影响也做了初步探究。首先我们从人工发酵的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中提取制备了 PHME,采用高效液相色谱法和比色法测定PHME中主要成分的含量。结果表明:PHME中腺苷、鸟苷、尿苷、虫草素、总糖、还原糖和甘露醇的含量分别为0.33%、0.44%、0.94%、0.53%、3.96%、3.18%和 25%。在机体当中,调控脂肪分解是调控脂代谢的重要途径。脂肪细胞内的脂质分解主要受ATGL、HSL和MGL三种水解酶的调控作用。此外还受到PerilipinA蛋白因子以及cAMP-PKA、ERK1/2、AMPK等信号通路的调节。本课题主要围绕PHME与上述脂解相关蛋白和信号通路的关系进行探究。通过检测细胞培养液上清中的甘油含量和脂肪细胞中的甘油三酯含量,发现PHME不仅可以促进基础状态下脂肪细胞的脂肪分解,而且能够促进异丙肾上腺素或毛喉素刺激状态下的脂肪分解。通过检测脂解相关蛋白和转录因子的表达水平,发现PHME能够促进HSL蛋白中Ser563和Ser660两个活性位点的磷酸化,从而促进其水解活性;此外,PHME还可促进ERK蛋白磷酸化,并降低PerilipinA的mRNA和蛋白的表达水平;但对AMPK及其磷酸化无明显影响。之后使用ERK1/2蛋白抑制剂PD98059和PKA蛋白抑制剂H89进一步探究PHME的作用机制,发现PD98059逆转了 PHME对ERK蛋白磷酸化的激活以及对PerilipinA的下调,并削弱了 PHME促进细胞甘油释放的作用;H89削弱了 PHME激活HSL的作用,并抑制了 PHME促进细胞甘油释放的功能。证明PHME一方面可通过激活cAMP-PKA信号通路,磷酸化HSLSer563和Ser660位点,活化HSL水解酶,促进脂肪分解;另一方面,PHME能够通过激活ERK信号通路,下调PerilipinA的表达,促进脂滴暴露,进而促进脂解。对PHME中五种单体对脂肪细胞脂解的影响进行研究,结果显示只有虫草素能够促进脂肪分解。通过检测脂解相关蛋白和转录因子的mRNA和蛋白表达水平,发现虫草素主要通过下调PerilipinA和PPARγ来促进脂解。本文采用油酸钠诱导HL7702肝细胞形成脂肪变性肝细胞模型,初步探究了PHME和虫草素对脂肪变性肝细胞内甘油三脂积累的影响。实验结果表明:PHME和虫草素均能明显减少油酸钠诱导的HL7702肝细胞内甘油三脂(TG)的积累,改善肝细胞脂肪变性。PHME可下调C/EBPα的表达,从而抑制脂肪的生成,PHME下调了 p-JNK水平,缓解了因JNK激活对游离脂肪酸(FFA)β-氧化的抑制。而虫草素不仅能够通过抑制C/EBPα和PPARy的表达,来抑制脂肪的生成;而且能够激活AMPK和上调PPARα表达,来促进FFA的β-氧化,减少HL7702肝细胞中TG的积累。综上所述,PHME和虫草素不仅能够促进分化成熟的3T3-L1脂肪细胞的脂肪分解,而且可明显降低油酸钠诱导的肝细胞脂肪积累,改善肝细胞脂肪变性。