狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus, RABV)引起的所有温血动物都易感的一种高致死性传染病,一旦发病100%死亡。我国作为狂犬病高发国家,每年狂犬病发病和死亡的人数居于世界第二位,仅次于印度。尽管我国在狂犬病防控方面采取了一定的措施,但是近年来新报告狂犬病的县市数量大幅增加,民众对狂犬病的紧张情绪急剧上升,甚至谈犬色变,造成了严重的社会恐慌。由于我国在狂犬病研究方面基础薄弱,对动物狂犬病从未进行过连续的、系统的流行病学调查等原因,直接导致了缺乏完整的动物狂犬病流行病学资料,不清楚狂犬病在我国的流行病学本底,使该疫病的防制工作带有很大的盲目性。自2004年起,笔者所在实验室在我国17个省市自治区开展了连续性、系统性的大规模动物狂犬病监测工作,笔者自2010年起参与此项研究。1.我国动物狂犬病流行病学监测。根据监测性质的不同将采集的样品分为两类： (1)随机采集犬脑组织和唾液拭子样品：采集自发生狂犬病疫情后安全扑杀的疫区犬、屠宰犬以及农村外表健康犬的脑组织或唾液拭子样品,其中脑组织9454份,唾液拭子10044份。(2)临床疑似狂犬病动物脑组织样品：主要是疑似狂犬病发病动物脑组织共计130份,动物种类包括犬、牛、羊、猪、骆驼、貉、野生狐狸等。本研究使用荧光抗体实验(FAT)、反转录套式PCR方法(RT-nPCR)和一步法荧光定量PCR方法,对各地采集和送检的19628份动物脑组织和唾液拭子样品进行狂犬病病毒的检测。2004～2014年临床出现疑似狂犬病症状的动物脑组织样品130份,其中RABV阳性样品100份,阳性率为76.92%(CI 68.7～83.9%)。动物感染谱分析结果表明,发病犬仍是我国大部分地区狂犬病的主要传播来源,而新疆和内蒙古等边境地区,野生狐狸是狂犬病的重要传播来源,暴露的动物主要为牛、羊和骆驼等家畜。在狂犬病高发和重点省份,随机采集犬脑组织样品9454份,其中狂犬病病毒阳性样品31份,RABV携带率为0.33%(C10.2～0.5%)。各省动物狂犬病阳性率与近年来人狂犬病死亡数呈正相关。比较两种监测方法,发现与随机采样相比,监测临床出现疑似狂犬病症状动物,不仅能够获得更多有效的背景信息,更易溯源,而且能够大幅度降低检测成本,提高监测效率。有文献表明部分人狂犬病疫情是被携带RABV的外表健康犬舔舐、咬伤所致,我国动物狂犬病监测方案中一直将犬唾液拭子列为监测项目,为评估监测犬唾液拭子样品的有效性,本研究采集并检测农村外表健康犬唾液拭子样品10044份,其中阳性样品21份,阳性率为0.21%(C10.1～0.3%)。唾液排毒具有间歇性,犬群体的唾液RABV检测结果不能真实反映该群体狂犬病毒感染情况,以犬唾液拭子阳性率反映犬群中RABV携带状态并不科学。2.狂犬病病毒流行毒株系统进化分析本研究利用RT-PCR方法对实验室分离的毒株进行N和G基因序列测定,对我国RABV流行毒株与周边国家毒株的N基因系统发生分析,对不同进化群G蛋白重要氨基酸位点进行比较,分析近年来我国RABV毒株进化特征。对本研究分离53株毒株和我国已发表毒株的进行N基因系统发生分析,将我国流行毒株分为4个进化群,即亚洲1群、亚洲2群、北极相关群和世界群。亚洲1群分布最广,在我国中部和东南部的22个省份流行；亚洲2群在我国东南12个省市流行；北极相关群主要在内蒙古传播流行；世界群毒株在我国散在分布,其分支世界群草原型毒株主要在新疆和内蒙流行。4个进化群毒株在地理分布上有一定重叠。将本研究获得的45条RABV街毒株G基因进行系统发生分析,将毒株分为4个进化群,各群的划分与基于N基因序列的划分基本一致。比较G蛋白氨基酸序列发现,亚洲1群和亚洲2群的代表株均在VI抗原位点发生R→H的替换,所有毒株在决定病毒毒力的重要基因位点(G蛋白抗原位点Ⅲ的333位)未见改变。除亚洲1群代表株在与p75NTR受体的结合位点处(318～35: aa)发生V→(332aa)的替换,其他群毒株在与组织嗜性有关的区域未见氨基酸替换。RABV流行株在环境压力选择下保持稳定,不同进化群特异性氨基酸替换可能是RABV区域性进化的结果。3.论文创新点(1)在我国开展大规模动物狂犬病流行病学监测,监测地域涵盖之广、采集样品种类、数量之多,尚属首次。明确了我国动物狂犬病流行病学本底,掌握了各地区狂犬病流行特点。(2)首次发现以往在俄罗斯、蒙古、哈萨克斯坦等国野生狐狸和狼中流行的世界群草原型RABV,已经在我国新疆和内蒙地区传播流行,且在新疆和内蒙古形成了各自独立的传播圈。(3)首次发现以往在貉群中传播的北极相关群RABV已在犬群中传播流行。(4)国家农业部根据本研究结果,修改了国家年度动物狂犬病监测计划,将监测工作的重点从监测外表健康动物转至监测临床疑似动物。