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本研究以成年健康雄性牦牛和犏牛为研究对象,采用RT-PCR技术克隆筛选Boule基因的选择性剪接体,对基因序列及其编码的蛋白质结构和功能进行分析,实时荧光定量PCR技术检测Boule基因的选择性剪接体在牦牛和犏牛睾丸组织中的表达水平并且运用同源扩增、PCR克隆测序方法获得牦牛睾丸组织Boule基因差异甲基化区（DMR）序列,运用亚硫酸氢钠测序法检测了该基因基因DMR甲基化状态,为研究犏牛雄性不育与DNA甲基化的关系提供理论基础。1Boule基因选择性剪接体的克隆筛选本试验根据黄牛Boule基因序列（NM001102115）设计两对引物,采用RT-PCR技术着重对Boule基因的开放阅读框进行扩增,结果第一对引物扩增出两条序列长分别为802bp和766bp,第二对引物扩增出的序列长362bp,序列拼接后为两条序列：1037bp、1001bp,GenBank登录号分别为：GU187434; GU187435。对这两条序列进行分析,我们找到了标准的"GT"、"AG"位点,严格遵循"GT-AG"剪接规则。因此我们可以断定这两条序列为Boule基因的两条选择性剪接体,分别命名为Boulel、 Boule2。2Boulel、Boule2核苷酸及蛋白序列的生物信息学分析分析借助生物信息学网络资源和相关生物学软件,筛选出的Boulel（?）勺开放阅读框长849bp,跟正常序列相比缺失了外显子3的5’端36bp碱基,从而导致开放阅读框少了12个氨基酸残基,氨基酸比对发现剪接部位位于RRM结构域内,但是没有影响到RNP1、RNP2区域,Boule基因的Reapt区域未发生剪接；Boule2的开放阅读框长813bp,跟正常序列相比缺失了外显子3的5’端72个bp碱基,从而导致开放阅读框少了24个氨基酸残基,氨基酸比对发现在RRM区域没有发生剪接,选择性剪接发上在Boule基因的Reapt区域。对两者的蛋白分析发现,Boulel比Boule2少一个α螺旋,它们的RRM三维结构也证实了这一点,推测Boulel与雄性不育有着密切的关系。3牦牛和犏牛睾丸组织中Boulel、Boule2的mRNA表达水平利用Real-time PCR技术对牦牛和犏牛睾丸组织中Boulel、Boule2的mRNA的表达进行定量分析,结果表明牦牛睾丸组织中剪接体Boulel的mRNA表达量高而犏牛的表达量低,其中犏牛与牦牛的表达量差异极显著（P<0.01）。牦牛睾丸组织中剪接体Boule2的mRNA表达量高而犏牛的表达量低,其中犏牛与牦牛的表达量差异不显著（P>0.05）。4牦牛Boule基因5’端CpG岛的分子克隆及序列分析本实验根据黄牛Boule基因序列（NW001494657.1）设计引物扩增了牦牛Boule基因的5’端序列,并对牦牛、黄牛和犏牛Boule基因的甲基化水平进行了分析,结果发现：牦牛Boule基因的5’端存在CpG岛,CpG岛长2000bp,包含启动子区、第一外显子和第一内含子；犏牛Boule5’端DNA甲基化水平（17.5%）极显著高于黄牛（5.2%）和牦牛（7.0%）（P<0.01）。可见犏牛Boule基因的高甲基化与其mRNA表达缺乏、雄性不育的表型是一致的,说明Boule基因的甲基化对Boule基因mRNA的表达调控起重要作用,可能对犏牛生精细胞减数分裂、雄性不育有重要影响。