【摘 要】
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异槲皮素是一种在植物中分布较广的黄酮类化合物.异槲皮素在自然界中含量很低,制约了人们对异槲皮素进行研究.利用微生物酶法,以芦丁为前体物质水解掉一个α-鼠李糖基,即可获
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异槲皮素是一种在植物中分布较广的黄酮类化合物.异槲皮素在自然界中含量很低,制约了人们对异槲皮素进行研究.利用微生物酶法,以芦丁为前体物质水解掉一个α-鼠李糖基,即可获得异槲皮素.本文主要研究微生物sp.R9g产芦丁-α-鼠李糖苷酶的分离提纯,酶反应条件,酶反应性质,以及测定酶蛋白的N-端氨基酸序列.Sp.R9g的发酵粗酶液经硫酸铵沉淀、透析后,利用DEAE-Cellulose DE52柱(Ф2.0×11.5)进行分离提纯,并进一步用Bio-Rad阳离子交换柱纯化,获得了提纯的芦丁-α-鼠李糖苷酶.使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,得到单一单点,该酶的分子量约为72kDa.对芦丁-α-鼠李糖苷酶的酶反应条件进行了研究,其结果为:酶反应的最佳底物浓度为1.0mg/ml,最佳酶反应时间为18个小时,最佳温度是40℃,最适pH值是5.0.对芦丁-α-鼠李糖苷酶的底物水解能力进行了研究,结果提纯的酶液对底物芦丁有很高的酶活力,为41.3 U/ml;对底物pNPR和人参皂苷Re的酶活力很低,分别为1.2 U/ml和0.9 U/ml.说明芦丁-α-鼠李糖苷酶具有专一水解芦丁的3-C上的1,6-α-鼠李糖苷键的特异性,是专一性酶.对芦丁-α-鼠李糖苷酶做蛋白质电印迹和蛋白质N-端序列进行测定,其N-端的16个氨基酸残基依次为:Leu/Ser/Ala/Ala/Glu/Trp/Arg/Thr/Gln/Ser/Ile/Tyr/Phe/Leu/Leu/Thr,并测定提纯的芦丁-α-鼠李糖苷酶的蛋白质纯度为97％.以这段序列为基础,在国际互联网蛋白质序列数据库中作蛋白质同源性比较,发现与蛋白质数据库中已知的蛋白质没有同源性.
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