论文部分内容阅读
干旱是影响植物分布和农作物产量的一个重要环境因子。植物在逆境下产生一系列的生理、生化反应以应对环境的变化,包括分子水平的。植物耐旱性是一个数量性状(QTL),即有多个基因控制。从植物耐旱的信号传导途径可以将这些基因分为两类:依赖于ABA(ABA-dependent)信号传导的抗旱途径和不依赖于ABA(ABA-independent)信号传导的抗旱途径。本研究是以依赖于ABA信号传导的耐旱途径的两个基因NCED和脱水素基因(DHN)为研究对象的。9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)是植物激素脱落酸(ABA)生物合成途径中的关键酶,因此是依赖于ABA信号传导耐旱途径的上游基因。脱水素基因(DHN)是依赖于ABA信号传导抗旱途径的下游基因,主要功能是在植物脱水状态下维持细胞结构的稳定性,可在干旱和ABA条件下诱导表达。本文首先以苹果为材料分别从叶片和果实中克隆了脱水素基因Mddehydrin和MdNCED的cDNA和DNA,并对其进行了干旱条件下的表达研究;其次,以模式植物野生番茄的两个种秘鲁番茄(Solanum peruvianum)和智利番茄(Solanum chilense)的不同群体为研究对象,分别克隆了LeNCED1和脱水素基因pLC30-15的DNA片段,并对其进行分子特性和一致性分析。最后对获得的野生番茄两个基因的序列进行遗传进化分析,试图找到群体适应性的遗传学证据。主要研究内容及结果如下:1.从苹果果实中克隆了MdNCED的cDNA和gDNA序列。序列分析表明该cDNA长1945bp,编码607个氨基酸。gDNA序列中没有内含子。在果实生长初期,MdNCED表达水平较低,随着果实成熟,表达量开始增加,当果实进入成熟期后表达水平达到最大值,以后表达量基本不变。说明本研究克隆到的MdNCED基因与果实成熟有关,负责果实成熟过程中ABA的合成。2.从苹果叶片中克隆了脱水素基因Mddehydrin的cDNA和gDNA序列。序列分析表明cDNA长848bp,编码230个氨基酸。gDNA序列由2个外显子和1个内含子组成。该基因具有脱水素的特征motif,一个S-segment,两个Y-segment和三个K-segment,是Y2SK4型脱水素基因。在0、2、4、6、8d干旱处理下,采用实时定量PCR技术分析表明:在正常水分条件下,Mddehydrin基因的表达量非常低,随着干旱程度的加重,其表达量开始逐渐增加,第6天时显著增加,并达到最大值,几乎是正常条件下表达量的200倍。随后表达量开始下降至最大值的25%左右。结果充分证实了干旱可以强烈诱导Mddehydrin基因的表达。3.以模式植物野生番茄的两个种秘鲁番茄和智利番茄为材料,克隆了6个群体的30个个体的LeNCED1基因DNA片段。获得的基因片段长1827bp,无内含子区。其推导氨基酸序列与马铃薯StNCED1基因一致性极高,为96.8%。4.以模式植物野生番茄的两个种秘鲁番茄和智利番茄为材料,克隆了6个群体的30个个体的脱水素基因pLC30-15的DNA片段,共获得60条等位基因序列。获得的基因片段长918bp包含5’端非编码区,一个内含子区和二个外显子区。在第一个外显子区的尾部有一个富含丝氨酸残基的保守序列称为S-segment;在第二个外显子区有3个富含甘氨酸和赖氨酸残基的保守序列K-segment,是SK3型脱水素基因。对SK3型脱水素基因推导氨基酸的多序列比对发现该基因与马铃薯(AY292655)的一致性很高,达到91%。5.对从两个野生番茄种克隆的60条LeNCED1基因序列的核苷酸多态性分析表明:(1)该基因所有核苷酸位点(all sites)的多态性水平在两个野生番茄种上都非常低,仅是中性位点的平均核苷酸多态性水平的二分之一;而沉默位点(silent sites)的核苷酸多态性水平与中性位点的相当。(2)相对地,智利番茄的核苷酸多态性水平高于秘鲁番茄,主要是因为智利番茄在非同义位点的核苷酸多态性水平比较高。综合以上两点可以推测,LeNCED1基因在两个番茄种上都经历过淘汰选择的作用,但作用在秘鲁番茄的选择压力要强于智利番茄。(3)无论是秘鲁番茄还是智利番茄在LeNCED1位点的dN/dS比值都非常小(<0.10),这也说明了淘汰选择曾作用于该位点。6.pLC30-15基因在两个野生番茄种所有核苷酸位点的多态性水平明显高于LeNCED1基因和中性位点的平均核苷酸多态性水平,但在保守序列区(S-和K-segments)的核苷酸多态性水平比较低。7.pLC30-15的dN/dS比值也小于1,但却是LeNCED1基因的10倍,说明淘汰选择也曾作用于pLC30-15,但作用强度比LeNCED1小。LeNCED1和pLC30-15在dN/dS比值上的差距主要体现在前者同义位点替代(dS)是pLC30-15的3倍,而非同义位点替代(dN)却只有pLC30-15的1/2。8.用Fst对群体分化水平的检验结果表明:(1)智利番茄的两个群体Tacna和Moquegua在两个位点上的分化水平都非常低(Fst接近零),这与中性位点的结果一致,因此可以将这两个群体合并为一个集合,命名为TacMoq。TacMoq和Quicacha分化水平却较高。(2)LeNCED1的Fst值是中性位点的2倍,表明有强的淘汰选择作用在基因上。(3)智利番茄的群体间分化水平高于秘鲁番茄各群体间的分化水平。(4)除Tacna-Mocquegua外,智利番茄的各群体间的分化水平都高于中性位点。(5)在pLC30-15基因上Tacna和Moquegua的高分化水平也是群体对当地环境适应的一个证据。9.应用Tajima’s DT和Fu & Li’s检验对两基因位点各群体进行了中性检验,其它各群体没有发现偏离中性理论,除了Quicacha群体在pLC30-15上的DT和DFL正显著,也高出中性位点的值。说明平衡选择或多向选择曾作用于这个群体。10.发现Quicacha群体的10个等位基因只有3个单倍体型,Haplotype 1,Haplotype 2和Haplotype 3。Haplotype 1与Haplotype 2之间只有两个核苷酸位点不同;而Haplotype 3与前两者有较大差距。对Quicacha单倍体型检验值也极显著(P=0.006)。结合Quicacha正显著的Tajima DT值考虑,是多向选择而不是群体规模变化效应(demographic effect)造成Quicacha这种单倍体型模式的。