本研究以番茄嫩叶为试验材料,提取幼嫩叶片的RNA,翻转录的cDNA为模板,克隆了番茄红素分解两个关键酶基因,即β环化酶和ε环化酶基因,并分别构建了这两个基因的反义表达载体,在此基础上又构建了这两个基因反义融合的表达载体。与此同时,对该品种的番茄再生体系也进行了优化,为下一步转化做好了准备。目前取得的结果总结如下:1利用尿素-Licl法提取番茄叶片中的RNA,根据Genbank登陆的番茄红素环化酶基因,即β环化酶基因和ε环化酶基因的保守序列设计特异性引物。提取番茄叶片的RNA,经RT-PCR反应,扩增出723 bp和569 bp的目的片段,将它们分别连接到Peasy-T1 Cloning Vector上,测序鉴定其正确性。通过Genebank序列分析比对,克隆到的基因与番茄红素环化酶基因同源性达到100%,由此可以看出,这两个基因正是所需要的番茄红素环化酶基因。2对克隆到的两个基因测序序列用分子生物学软件primer 5.0进行分析酶切位点,筛选出合适的插入方向的基因。挑取番茄红素β环化酶基因正向插入克隆载体的基因,构建番茄红素β环化酶的反义表达载体pro-b;而番茄红素ε环化酶基因表达载体的构建则是选取了反向插入克隆载体的基因,这样酶切连接到PROK2上时正好是反向表达的,因此也构建成功了番茄红素ε环化酶基因pro-e。在构建反义融合基因时,利用两个基因的共同酶切位点,亚克隆成融合基因PUC-b+e,然后再将克隆到的基因与PROK2连接,构建成了番茄红素β环化酶和ε环化酶融合基因的反义表达载体pro-b+e。3在前人研究的基础上,以番茄子叶为受体材料,研究了不同激素配比对再生芽的影响、不同激素配比对生根的影响、番茄褐化现象的控制等。试验发现,再生芽以培养基MS+ZT1.5(mg/L)+IAA0.2(mg/L),再生率最高;选用12d苗龄的子叶再生率最高;再生芽生根培养基则以1/2MS(MS)+IAA0.2(mg/L)时,生根最早,生根量最多;另外,在解决番茄褐化现象上,通过反复试验发现,柠檬酸在30mg/L时,不仅促进再生,而且大大降低了番茄易褐化的问题;另外柠檬酸在25mg/L时也同样大大降低了再生根的褐化现象。