背景胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，虽然近年来似有减少的趋势，但其发病率仍高居各种恶性肿瘤之首。在对胃癌发生发展相关因子的研究中，现已证实胃癌的发生发展与抑癌基因、癌基因、DNA修复基因、细胞粘附分子、端粒／端粒酶、细胞周期调节因子和生长因子／受体系统等基因的改变有关。随着研究的深入，与胃癌有关的癌基因及抑癌基因不断被发现，这些都进一步阐明了胃癌的发生机制，也为胃癌的治疗提供新的靶向。近年来，研究人员发现在胚胎发育、组织分化过程中起调控作用的信号通路可能在肿瘤发生的过程中发挥着重要作用。“控制脊椎动物胚胎发育的信号通路可能与人类肿瘤的发生有关”这一观点的提出，为肿瘤发生机制的研究提供了新的方向。Sonic hedgehog信号通路是目前研究较为深入的在人类胚胎发育过程中发挥着非常重要调控作用的信号通路。现已证实人类皮肤基底细胞癌、小细胞肺癌、胰腺癌、口腔鳞状细胞癌、前列腺癌、膀胱癌、髓母细胞瘤、胃癌等肿瘤的发生与sonic hedgehog信号通路异常激活密切相关。该信号通路主要由分泌型信号糖蛋白Shh配体、跨膜蛋白受体Ptch和另一跨膜蛋白Smo组成的复合物，以及下游转录因子Gli蛋白(Gli1、Gli2、Gli3)组成。目前发现Sonic hedgehog信号通路异常激活存在着两种激活方式：1)配体非依赖性激活方式：即由细胞内的Ptch基因发生功能缺失性突变或Smo基因发生功能获得性突变而导致细胞内信号通路的异常激活；2)配体依赖性激活方式：即由细胞外旁分泌的Shh配体过度表达，与细胞膜上的Ptch受体结合，从而激活细胞内的信号通路。已有研究证实胃癌组织中存在着Shh、Ptch的高表达，提示胃癌的发生与Sonic hedgehog信号通路的异常激活有关，并推测胃癌组织中Sonic hedgehog信号通路异常激活的机制可能为：配体依赖性激活方式，即由细胞外旁分泌的Shh配体过度表达，与细胞膜上的Ptch受体结合，从而激活细胞内的信号通路，导致肿瘤的发生和发展。但是上述所推测的异常激活机制却不能解释在Sonic hedgehog信号通路中作为抑癌基因的Ptch基因何以在胃癌组织出现高表达这一问题。Smo蛋白是Sonic hedgehog信号通路中的信息转换器，它能够把细胞外的Shh信号转换成细胞内的Gli1信号，从而启动细胞核内基因的转录，对Sonic hedgehog信号通路具有激活作用。目前已有研究证实Smo的功能获得性突变可以诱发人类基底细胞癌的发生，在家族性和散发性基底细胞癌中Smo的突变率为20％。同样，胃癌的发生是否也与Smo基因的功能获得性突变有关，以及胃癌发生过程中Sonic hedgehog信号通路异常激活是否存在Smo基因高表达所致的配体非依赖性激活方式，目前尚不清楚。目的研究Smo基因在胃癌发生发展过程中的作用，及其可能的作用机理。为进一步明确胃癌发生发展过程中分子作用机理，以及寻找胃癌生物治疗新的作用靶点提供理论依据。方法1．构建胃癌组织芯片，以正常胃粘膜组织作对照，应用免疫组化及原位杂交技术检测Smo蛋白及Smo mRNA在胃癌组织中的表达水平，并分析胃癌组织中Smo基因表达水平与胃癌病理类型、发生部位、临床病理分期的关系。2．构建胃粘膜不典型增生组织芯片，以正常胃粘膜组织作对照，应用免疫组化及原位杂交技术检测Smo蛋白及Smo mRNA在胃粘膜不典型增生组织中的表达水平，并分析胃粘膜不典型增生组织中Smo基因表达水平与不典型增生程度的关系。3．应用第一部分所构建的胃癌组织芯片，采用免疫组化技术检测胃癌组织中Gli1蛋白的表达水平，分析胃癌组织中Gli1蛋白表达水平与胃癌病理类型的关系，并结合第一部分所得出的Smo蛋白在胃癌组织中的表达结果，分析胃癌组织中Smo蛋白与下游转录因子Gli1蛋白表达的相关性。4．应用Western blot及半定量RT-PCR技术检测人胃癌MGCS03细胞中Smo蛋白及Smo mRNA的表达水平；体外化学合成3对针对Smo mRNA的特异性小片段干扰RNA(siRNA)，利用阳性脂质体转染方式将siRNA转染胃癌MGC803细胞，应用半定量RT-PCR鉴定各Smo siRNA序列干扰胃癌MGCS03细胞Smo基因表达的效果，筛选出干扰胃癌MGC803细胞Smo基因表达效果最明显的特异性siRNA；再应用Western blot、半定量RT-PCR及MTT法、流式细胞术检测Smo mRNA被降解后对胃癌MGC803细胞Gli1蛋白及Gli1mRNA表达的影响，以及对胃癌MGC803细胞增殖和凋亡率的影响。结果1、正常胃粘膜组织中Smo蛋白的阳性表达率为32％，表达强度多为弱阳性，胃乳头状腺癌、高分化管状腺癌、中分化管状腺癌、低分化腺癌组织中Smo蛋白的阳性表达率分别为85.7％、77.8％、88.5％、94.4％，表达强度多为阳性及强阳性；胃粘液癌、印戒细胞癌组织中Smo蛋白的阳性表达率分别为45.5％、14.3％，表达强度多为弱阳性。胃乳头状腺癌、高分化管状腺癌、中分化管状腺癌、低分化腺癌组织中Smo蛋白表达显著高于正常胃粘膜组织；胃粘液癌和印戒细胞癌中Smo蛋白表达与正常胃粘膜比较无显著性差异；另外，正常胃粘膜及胃癌组织中的Smo mRNA表达水平与Smo蛋白表达水平一致；不同临床病理分期胃癌组织中Smo蛋白表达强度有显著性差异，Ⅲ期、Ⅳ期胃癌组织中Smo蛋白表达强度显著高于Ⅰ期胃癌组织，而且Smo蛋白表达强度有随着胃癌临床病理分期的增加而增加的趋势。2、轻度、中度、重度不典型增生胃粘膜组织中Smo蛋白阳性表达率分别为：45％、48.4％、57.1％，表达强度多为弱阳性；胃粘膜不典型增生组织中Smo蛋白的表达有随着不典型增生程度加重而增加的趋势，但与正常胃粘膜比较，差异无显著性；胃粘膜不典型增生组织中的Smo mRNA表达水平与Smo蛋白表达水平一致；胃癌组织中Smo蛋白的表达显著高于胃粘膜不典型增生组织。3、正常胃粘膜组织中Gli1蛋白的阳性表达率为20％，表达强度多为弱阳性；胃乳头状腺癌、高分化管状腺癌、中分化管状腺癌、低分化腺癌组织中Gli1蛋白的阳性表达率分别为100％、100％、96.2％、100％，表达强度多为阳性及强阳性；胃粘液癌、印戒细胞癌组织中Gli1蛋白的阳性表达率分别为36.4％、7.2％，表达强度多为弱阳性；胃乳头状腺癌、高分化管状腺癌、中分化管状腺癌、低分化腺癌组织中Gli1蛋白表达显著高于正常胃粘膜组织；胃粘液癌和印戒细胞癌中Gli1蛋白表达与正常胃粘膜比较无显著性差异；胃癌组织中Smo和Gli1蛋白表达呈正相关，相关系数为0.924。4．胃癌MGCS03细胞中存在Smo蛋白、Smo mRNA的强表达；3对针对Smo mRNA的特异性siRNA中，siRNA-1干涉作用最明显，达61.7％，而siRNA-2干涉作用为41.2％，siRNA-3几乎不发生任何干涉作用；筛选出siRNA-1干扰胃癌MGC803细胞Smo基因表达效果最明显；另外，Smo基因表达被沉默后，胃癌MGCS03细胞Gli1 mRNA及Gli1蛋白的表达均有降低，Gli1 mRNA表达降低56.2％，Gli1蛋白表达降低61.3％；Smo基因表达被沉默后，胃癌MGC803细胞增殖于转染后24小时开始显著下降；Smo基因表达被沉默后，于转染48h胃癌MGCS03细胞细胞凋亡率为23.6％，与阳性对照组和阴性对照组比较，显著升高。结论1．胃乳头状腺癌、高分化管状腺癌、中分化管状腺癌、低分化腺癌等病理类型胃癌的发生与Smo基因有关，Smo基因的高表达可能激活某种机制而参与诱导该病理类型胃癌的发生，并且Smo基因表达水平的上调在推进该病理类型胃癌的病理进展过程中发挥着作用。2．Smo基因的高表达不是胃癌发生过程中的早期事件，而是在胃乳头状腺癌、高分化管状腺癌、中分化管状腺癌、低分化腺癌等病理类型胃癌发生过程中较晚期才出现的事件。3．Smo基因高表达在胃癌发生与发展过程中的作用机理，可能是通过上调下游转录因子Gli1蛋白的表达，异常激活Sonic hedgehog信号通路，从而诱导胃癌的发生与发展。4．胃癌MGCS03细胞中存在Smo基因的高表达，胃癌MGC803细胞的发生可能与Sonic hedgehog信号通路的异常激活有关。5．利用小RNA干扰技术沉默胃癌MGC803细胞Smo mRNA表达是有效可行的；胃癌MGC803细胞中Smo mRNA表达的沉默可以下调细胞内Gli1 mRNA及蛋白的表达，从而降低Sonic hedgehog信号通路的活性。6．Smo基因与胃癌MGCS03细胞的增殖凋亡有关，它可能参与调控胃癌MGC803细胞的增殖与凋亡，Smo基因可能作为一个癌基因在胃癌发生发展过程中发挥重要作用。7．在胃癌发生发展过程中Sonic hedgehog信号通路异常激活机制除了配体依赖性激活方式外，可能还存在配体非依赖性激活方式：即Smo基因发生功能获得性突变，使Smo蛋白出现高表达致使Sonic hedgehog信号通路异常激活，导致肿瘤的发生和发展。