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拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)是我国最重要的海水养殖蟹类之一，具有重要的营养价值和经济价值。集约化的养殖模式导致了近年来拟穴青蟹的疾病不断爆发，其中以弧菌等革兰氏阴性菌为主的细菌性病原是导致青蟹发病的重要诱因之一。然而由于对病原微生物感染拟穴青蟹的致病机理知之甚少，目前对其尚无有效的免疫防治措施。因此，阐明病原微生物的致病途径对于控制拟穴青蟹疾病爆发具有重要的意义。
病原微生物在长期的进化过程中发展出一整套逃避、干扰、抑制和对抗宿主免疫系统的机制，其中利用宿主的细胞膜结构和受体蛋白进入胞内是病原微生物感染宿主的重要途径之一。为了研究病原在入侵拟穴青蟹过程中与宿主作用的关键蛋白，进而为有效阻断病原微生物入侵途径提供理论依据，本论文比较系统地研究了细胞膜脂筏结构相关基因SpFLT-1的结构特点、组织器官分布特性以及溶藻弧菌诱导后的体内表达模式，并通过体外培养原代青蟹血淋巴细胞，初步探讨了SpFLT-1在弧菌内吞过程中可能发挥的功能，该项研究为初步阐明病原微生物感染拟穴青蟹的致病机制奠定了理论基础。取得的结果如下:
1成功构建了LPS刺激拟穴青蟹血淋巴细胞SSHcDNA文库。本试验以雌性拟穴青蟹为对象，利用抑制差减杂交技术(Suppressionsubtractivehybridization，SSH)构建了脂多糖(Lipopolysacchadde，LPS)刺激下血淋巴细胞cDNA文库，文库总容量为1.2×105cfu。随机选取了721个克隆子进行测序，共获得271个上调表达基因。利用AmiGO基因释义工具，将所有271个基因按照参与的生物学过程进行分类，其中179个基因分别参与6个不同的生物学过程，92个基因属于完全未知功能的基因。值得一提的是，上述271个基因中只有18个基因(6.6％)在甲壳类动物中报道过，其余253个基因均是首次在拟穴青蟹中发现。从该文库中筛选获得细胞膜脂筏结构相关基因flotillin-1(SpFLT-1)。
2克隆获得拟穴青蟹膜脂筏结构基因flotillins家族成员SpFLT-1的全基因序列和另一成员SpFLT-2的全长eDNA序列。SpFLT-1的全长cDNA序列包括1278bp的开放阅读框(Openreadingframe，ORF)、42bp的5非翻译区(Untranslatedregion，UTR)和103bp的3UTR三部分(GenBank登录号:FJ774690)。预测该基因编码426个氨基酸，编码的蛋白分子量为47kDa。SpFLT-1基因包含9个外显子和8个内含子，其DNA侧翼片段长度为1310bp(GenBank登录号:JX228176)。SpFLT-2的全长cDNA序列包括1317bp的ORF、339bp的5UTR和171bp的3UTR三部分(GenBank登录号:KC865733)，预测其编码439个氨基酸，编码的蛋白分子量为48kDa。
3以纯化的拟穴青蟹SpFLT-1原核表达产物制备了特异性强且效价高的多克隆抗体。根据SpFLT-1基因的全长cDNA序列，构建了pET-28a(+)/SpFLT-1融合表达载体，并成功在大肠杆菌中诱导表达出重组蛋白。纯化的蛋白经质谱鉴定为目的蛋白。利用纯化好的目的蛋白制备了特异性强、效价高的多克隆抗体，可以用于后续蛋白功能的相关研究。
4分析了拟穴青蟹SpFLT-1和SpFLT-2基因的组织表达分布特性以及在青蟹不同发育阶段的表达模式。结果表明SpFLT-1基因在各组织器官中表现出组成型表达特点，血淋巴细胞中表达量最高;SpFLT-2基因在各组织器官中表达水平较一致。SpFLT-1mRNA在青蟹胚胎发育早期表达量较高，伴随着生长发育进程其表达量逐步降低;SpFLT-2基因在溞状幼体Ⅰ期表达量最高。SpFLT-1和SpFLT-2两个基因的转录水平在卵巢发育早期表达量最高，随着拟穴青蟹逐渐性成熟过程，两个基因转录水平有降低的趋势。
5研究了SpFLT-1蛋白在拟穴青蟹部分组织器官中的表达及分布特征。选取了SpFLT-1mRNA表达水平较高的5个组织器官:卵巢、鳃、胸神经团、心脏、中肠，利用Western-blot技术研究了SpFLT-1蛋白表达模式。SpFLT-1蛋白在中肠中表达量最高。免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)试验结果显示SpFLT-1蛋白广泛分布于青蟹卵泡上皮细胞、鳃丝上皮细胞层、胸神经团神经细胞、心肌外膜以及中肠的上皮细胞层中。
6分析了溶藻弧菌感染拟穴青蟹后SpFLT-1基因在血淋巴细胞和鳃中转录和翻译水平变化。结果显示，青蟹感染溶藻弧菌3h后，SpFLT-1mRNA在血淋巴细胞和鳃中显著上调表达。梯度密度离心和Western-blot结果发现SpFLT-1蛋白不仅分布于青蟹血淋巴细胞和鳃上皮细胞的膜脂筏结构中，还可能在胞内表达并发挥特定的功能;SpFLT-1蛋白与弧菌蛋白之间可能相互作用，二者作用时间短暂。结果提示SpFLT-1在青蟹血淋巴细胞和鳃细胞中可能是溶藻弧菌入侵宿主细胞的关键蛋白。
7初步探讨了SpFLT-1基因在拟穴青蟹血淋巴细胞内吞溶藻弧菌过程中的作用。在体外成功培养拟穴青蟹原代血淋巴细胞的基础上，利用RNA干扰技术(RNAinterference，RNAi)特异性地抑制SpFLT-1mRNA表达。RNAi试验后，SpFLT-1dsRNA处理组与对照组相比细胞的内吞效率降低，该结果进一步从体外验证了SpFLT-1可能是溶藻弧菌入侵宿主细胞关键蛋白的推测。