结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的恶性肿瘤之一,全世界每年大约有140万新发病例,同时至少70万患者死亡。在我国,大肠癌在恶性肿瘤中已排第4～6位,尽管目前结直肠癌相关手术、放化疗方案的治疗方法,已经提高了早期患者的生存率,但大多数伴有转移的结直肠癌患者不适合传统的治疗方式,五年生存率<10%。发病年龄趋向年轻化,严重影响国人健康水平。目前临床常用的抗肿瘤化学治疗药物均有不同程度的毒副作用,它们在杀伤肿瘤细胞的同时,也杀伤正常组织的细胞。同时,肿瘤细胞的抗药性在很大程度上加重了人类对新型抗肿瘤药物需求的紧迫性。而由于基因的不稳定性和肿瘤细胞的异型性,从基因或其他方面研究具体肿瘤,是一项异常艰巨的任务。因此,研制新的抗肿瘤药物、改变药物的抗肿瘤作用方式,这是摆在科研工作者面前的重要研究课题。抗癌蛋白(anticancer protein)是随着肿瘤研究的不断进展,基于免疫和分子生物学的发展被新近提出的一种治疗策略,已成为肿瘤治疗研究的一个新的热点。抗肿瘤蛋白特点为分子质量小,极易穿透瘤细胞,具有较强的稳定性,可以通过提高免疫应答、抑制肿瘤血管形成、直接诱导肿瘤细胞凋亡或阻滞肿瘤细胞周期等作用方式抑制肿瘤的生长和转移。通过前期实验研究我们发现了一个人类功能未知的新基因,其对结肠癌细胞系LoVo细胞存在有丝分裂抑制作用,故将其命名为AC-01。经过生物信息学分析,我们发现AC-01,即为FAM172A (family with sequence similarity 172, member A),定位于染色体5q15,其表达范围广泛,包括单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、人胚胎肾细胞、尿道上皮、肝细胞、大肠上皮细胞及多种肿瘤细胞。进一步研究发现,FAM172A能够显著抑制人大肠癌细胞系LoVo细胞的增殖,那么,FAM172A有可能通过抑制人大肠癌细胞LoVo细胞的有丝分裂从而达到抑制其增值的作用。根据近年来有关抗癌蛋白的研究,我们推测FAM172A可能是一种抗癌蛋白,该基因是一个典型的抑癌基因,这就提示FAM172A蛋白将可能成为一种新的抗癌蛋白用于大肠癌的生物治疗。因此,本课题计划在前期实验基础上,进一步明确FAM172A抑制大肠癌生长的核心作用,拟探讨FAM172A基因表达调控机制,主要明确其转录前水平的调节机制,即研究该基因的核心启动子以及调控其表达的关键转录因子,为FAM172A应用于大肠癌的生物治疗提供实验证据。目的：进一步明确FAM172A对大肠癌细胞的抑制作用,并探讨其转录调节机制。方法：1、生物学信息学分析利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在线查找FAM172A的mKNA序列,用mRNA序列在人类基因组序列作BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),寻找最匹配的基因组序列,确定基因转录起始位点,其中转录起始位点处的第一个核苷酸定位为+1。使用UCSC Genome Browse (http://genome.ucsc.edu/)和Ensemble Genome Browse (http://asia.ensembl.org/index.html)预测FAM172A基因的启动子序列。2、全基因组DNA提取与质粒构建根据NCBI检索出的FAM172AmRNA序列及预测的启动子序列,使用软件Vector NTI Advance 11.5.1设计其特异性引物,扩增其DNA(其中,扩增FAM172A启动子序列时,使用Genomic DNA Purification kit (Promega)试剂盒提取人全血中全基因组DNA,以此为模板),并分别连接至pcDNA3.1(-)和pGL4.10载体,构建FAM172A蛋白基因及其启动子的重组质粒。3、明确FAM172A蛋白抑制大肠癌细胞增殖及促进凋亡分化的作用(1)从大肠癌细胞系LoVo细胞内提取总RNA,逆转录成cDNA后,成功扩增FAM172A序列,连接至pET32a(+),成功构建pET32a(+)-FAM172A重组载体,将构建好的pET32a(+)-FAM172A转化至大肠杆BL21(DE3), IPTG大量诱导表达并制备、纯化多克隆抗体；培养大肠癌细胞系LoVo细胞及SW480细胞,将提取的FAM172A重组蛋白按照不同的浓度(0、0.1、1.0、10和100ng/ml)与大肠癌细胞共培养,分别培养12、24、36、48h后,收集大肠癌细胞后,使用流式细胞术检测细胞周期及细胞数量；使用XTT实验检测大肠癌细胞的增殖情况；(2)将构建好的FAM172A重组质粒及FAM172A干扰质粒分别转染至大肠癌细胞中,培养48小时后,收集细胞,使用AnnexinV-7AAD试剂及流式细胞仪检测细胞凋亡情况；4、 FAM172A蛋白基因启动子的克隆与初步分析提取提取人全血全基因组DNA,根据生物信息学预钡FAM172A蛋白基因的启动子序列,设计其特异性引物,扩增其DNA,并连接至pGL4.10载体,构建FAM172A蛋白基因启动子的重组质粒,将构建好的FAM172A基因启动子的重组质粒转化大肠杆菌DH5α,扩增培养,并中提重组质粒,瞬时转染FAM172A重组质粒和pGL4.10空载至大肠癌细胞系LoVo细胞,利用Luciferase报告基因技术检测重组质粒的活性。5, FAM172A蛋白基因核心启动子的鉴定与分析通过不断截短上述构建启动子序列,设计各自特异性引物,扩增其DNA,并连接至pGL4.10载体,构建FAM172A蛋白基因各截短启动子的重组质粒,将构建好的FAM172A基因各截短启动子的重组质粒转化大肠杆菌DH5α,扩增培养,并中提重组质粒,瞬时转染FAM172A各截短重组质粒和pGL4.10空载至大肠癌细胞系LoVo细胞,利用Luciferase报告基因技术分别检测各截短重组质粒的活性,比较其活性,鉴定出核心启动子序列。6、关键转录因子对FAM172A蛋白的转录活性的作用研究根据生物信息学预测与FAM172A蛋白基因的核心启动子序列结合的转录因子,预测其序列,提取大肠癌细胞系LoVo细胞总RNA,逆转录为cDNA,设计转录因子的特异性引物,扩增其cDNA,并连接至pcDNA3.1(-)载体,构建转录因子的表达质粒。瞬时共转染核心启动子重组质粒和转录因子的表达质粒,通过设置分组,利用Luciferase报告基因技术,检测转录因子活性,再通过EMSA(电泳迁移率实验)、ChIP(染色质免疫沉淀)等实验技术鉴定出能与核心启动子序列特异性结合的关键转录因子。瞬时转染关键转录因子表达载体和转录因子的siRNA至大肠癌细胞系LoVo细胞,通过Real-time PCR和Western blotting观察FAM172A基因的转录水平以及蛋白的表达水平,从而说明转录因子对FAM172A蛋白转录水平的影响。7、统计学分析本实验采用SPSS20.0统计软件进行系统分析,文章中所有的计量资料的实验数据以均数±标准误来表示。计量资料的组间比较采用两独立样本的t检验,多组的组间比较采用方差分析。P<0.05为有统计学差异。本文所有实验均独立进行3次,取其平均值进行统计学分析。结果：1、为了验证FAM172A能否影响到大肠癌细胞的细胞周期,我们将提取的FAM172A重组蛋白按照不同的蛋白浓度,与大肠癌细胞SW480共培养,分别于12、24、36、48h收集细胞,使用流式细胞仪检测大肠癌细胞的细胞周期情况。我们发现处于S期的大肠癌SW480细胞及所有大肠癌细胞的数量均有所减少,并且随着FAM172A重组蛋白的浓度的增加,S期的大肠癌SW480细胞及所有大肠癌细胞的数量减少的就越多,呈剂量依赖性。另外,在FAM172A重组蛋白的最高浓度为0.1 μg/ml时,处于S期的大肠癌SW480细胞减少至3.18%。这些结果说明FAM172A能够明显抑制大肠癌细胞的增殖,尤其在FAM172A重组蛋白浓度高于0.1 μg/ml时。在XTT增殖实验中,我们发现,与对照组相比,FAM172A能够明显抑制大肠癌细胞的增长(p<0.01),且抑制FAM172A表达后,大肠癌细胞增长增多(p<0.05),且增长速度增加。这些结果表明FAM172A能够明显抑制大肠癌细胞的增殖。2、我们使用流式细胞仪技术检测FAM172A对大肠癌细胞系SW480细胞凋亡的影响,结果发现,过表达FAM172A能够使得大肠癌SW480细胞凋亡的数量增加(p<0.01),而抑制FAM172A表达后,大肠癌SW480细胞凋亡的数量明显减少(p<0.01),这些结果说明FAM172A能够促进大肠癌细胞的凋亡。另外,我们还发现,与FAM172A重组蛋白共培养后,分别在100倍和400倍显微镜下观察,相对于对照组来说,发现FAM172A能够诱导细胞分化。3、为了鉴定出FAM172A的启动子序列,我们搜索NCBI数据库和检索UCSC genome Browser (http://genome.ucsc.edu/)，获得FAM172A基因的mRNA序列,分析预测FAM172A基因的转录起始位点,通过BLAST,我们预测出FAM172A的启动子序列为-740bp至+205bp,成功扩增出FAM172A的启动子片段,将此预测的FAM172A的启动子片段连接至pGL4.10载体,限制性内切酶的分别为Xhol和EcoR V,我们将构建出的pGL4.10-FAM172A启动子重组质粒命名为P1,用于后续实验及各截短启动子的模板。将其转染至大肠癌LoVo细胞中,培养24小时后,我们采用Luciferase报告基因技术检测JFAM172A启动子的活性,结果使用Firefly/Renilla比表示。我们发现,与对照组pGL4.10 Basic空载相比,P1具有40倍的启动子活性,这提示我们预测的启动子片段在大肠癌LoVo细胞中具有启动子活性。随后我们不断截短P1片段,分别构建5个截短的启动子片段的重组质粒,分别命名为P2、P3、P4、P5和P6,Luciferase报告基因技术检测各截短启动子的活性。结果发现,在大肠癌细胞中,P6的启动子活性最高。通过不断的截短预测的启动子序列,我们发现截短启动子片段P6,-112 bp至+48bp,具有核心启动子所必需的序列及结合位点,且具有较高的启动子活性。4、接着,通过在线软件TFSEARCH(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCh. html) and GeneCards (http://www.genecards.org/)预测可能与FAM172A核心启动子结合的转录因子,我们发现,STAT1,一个得分最高的主要常见的转录因子,结合位点位于FAM172A核心启动子区域内。STAT1结合位点是-68bp和-58bp之间。5、为了验证STAT1能否与FAM172A启动子结合,我们做了染色质免疫沉淀(ChIP)及凝胶电泳迁移滞后实验(EMSA)。在ChIP实验中,我们成功扩增了FAM172A核心启动子序列,然后我们发现与IgG对照组相比,STAT1的结合位点位于FAM172A核心启动子序列中。这个实验说明STAT1能够特异性结合于FAM172A启动子序列。而在EMSA实验中,我们设计了一个能和STAT1结合位点序列相同的寡聚核苷酸,称为探针,用于这个实验,我们发现从大肠癌LoVo细胞中的核提取物,能够特异结合于带标签的探针,这些探针都具有STAT1结合位点序列,然后我们使用未标记的探针进行了竞争性实验,发现标记的探针超出未标记的100倍,这也说明STAT1能够结合于FAM172A启动子序列,综上所述,我们从体内和体外分别证明了STAT1能够特异性结合于FAM172A启动子序列。6、为了明确转录因子STAT1能否促进FAM172A基因的表达,我们进行了western blot和实时荧光定量PCR。我们将STAT1基因过表达及干扰质粒转染至大肠癌LoVo细胞中,发现过表达STAT1后FAM172A蛋白及mRNA水平均明显提高,干扰STAT1表达后,FAM172A蛋白及mRNA水平则出现下调。这些说明转录因子STAT1能够促进FAM172A的表达。结论：1、FAM172A能够抑制大肠癌细胞的增殖,并能够促进大肠癌细胞的凋亡；2、我们成功克隆并鉴定出FAM172A的启动子区域(-745bp至+205bp),具有明显的启动子活性,确定了FAM172A核心启动子区域位于-112bp/+48bp；3、转录因子STAT1能够特异性结合于FAM172A核心启动子区域,增强其启动子活性；4、转录因子STAT1能够促进FAM172A蛋白的表达；5、这些发现对全面认识FAM172A基因的基本功能及了解其转录调控机制有重大意义。