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目的:观察血管紧张素(Angiotensin,Ang)Ⅱ诱导的肥大心肌细胞经典瞬时受体电位(Canonical Transient Receptor Potential, TRPC)通道表达变化以及其对细胞缺氧复氧损伤的影响。探讨经典瞬时受体电位通道表达的分子机制和其在缺氧复氧诱导凋亡中的作用。方法:1.分离、培养健康新生Spraque-Dawley大鼠(2-5日龄)的心肌细胞2.终浓度为0.1μM血管紧张素Ⅱ刺激前述细胞48小时,诱导心肌细胞肥大。3.心肌肥大的鉴定:用BCA法测定细胞蛋白浓度,[3H]-亮氨酸掺入法检测心肌细胞蛋白质合成速率,应用Motic Images 1.3软件测量心肌细胞的表面积。4.实验分成7组:它们是对照组,AngⅡ组,SKF96365+AngⅡ组, Losartan+AngⅡ组,PD123319+AngⅡ组,U73122+AngⅡ组及CsA+AngⅡ组。5.样本进行细胞缺氧(5%CO2+95%N2)6小时,然后复氧(5%CO2+21%O2)4小时培养来模拟心肌的缺血再灌注。6.采用实时定量PCR技术检测心肌细胞经典瞬时受体电位通道TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6和TRPC7 mRNA的表达。7.采用蛋白杂交印迹技术,检测细胞经典瞬时受体电位通道TRPC1、TRPC3和TRPC6以及肌细胞结构蛋白α-fodrin的表达。8.采用Annexin V FITC/PI双染色进行流式细胞检测和Hoechst33258染色技术测定细胞凋亡率。结果:1.终浓度为0.1μM血管紧张素Ⅱ成功诱导出肥大心肌细胞。与对照组相比,血管紧张素Ⅱ刺激心肌细胞48h后,[3H]-亮氨酸掺入明显增加,(分别为2103±203 CPM/孔,n=6;1239±154 CPM/孔,n=6;p<0.05)。血管紧张素Ⅱ组的蛋白浓度高于空白对照组(分别为1503±146μg/well,n=6;1075±118μg/well,n=6;p<0.05)。Motic Images 1.3软件测量发现血管紧张素Ⅱ组细胞的表面积增加1.46倍。2.血管紧张素Ⅱ刺激心肌细胞48小时后,定量RT-PCR检测TPRC的mRNA发现: TRPC1和TRPC3的mRNA表达上调, mRNA的量分别是空白对照组的1.45倍和1.24倍(p<0.05,n=4);TRPC6的mRNA未发现有明显变化,(p>0.05,n=4);而TRPC2、TRPC4、TRPC5以及TRPC7的mRNA低于对照组(p<0.05,n=4)。3.运用蛋白杂交印迹技术发现,在AngⅡ组TRPC1对GAPDH的相对密度比要高于对照组,而在AngⅡ组中TRPC3与TRPC6对GAPDH的相对密度比无明显变化。表明血管紧张素Ⅱ在蛋白水平上调TRPC1表达,但未影响TRPC3和TRPC6表达。4.加入血管紧张素Ⅱ前,分别先加入AT1受体阻滞剂Losartan、AT2受体阻滞剂PD123319、磷脂酶C(Phospholipase C, PLC)抑制剂U73122、TRPC通道阻滞剂SKF96365和钙调神经磷酸酶抑制剂环孢素A(Cyclosporin A, CsA)。蛋白杂交印迹技术检测发现,Losartan+AngⅡ组的TRPC1低于AngⅡ组与对照组,这在U73122+AngⅡ组, SKF96365+AngⅡ组和CsA+AngⅡ组也呈现同样的结果。但PD123319+AngⅡ组是个例外。这表明Losartan, U73122, SKF96365和CsA都能抑制血管紧张素Ⅱ刺激的心肌细胞TRPC1的高表达。而AT2受体阻滞剂PD123319对血管紧张素Ⅱ刺激的TRPC1高表达无明显影响。5.[3H]-亮氨酸掺入法检测发现,SKF96365+AngⅡ组的放射性强度(1452±172 CPM/well)小于AngⅡ组放射性强度(2103±203 CPM/well)(n=6;p<0.05)。同时发现SKF96365+AngⅡ组的细胞表面积小于AngⅡ组,是空白对照组的1.29倍,而AngⅡ组的细胞表面积是对照组的1.46倍,两者相比有明显差异(p<0.05)。表明SKF96365能部分抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。6.心肌细胞缺氧6小时后再复氧4小时进行缺氧复氧损伤检测。(1)对照组,AngⅡ组与SKF96365+AngⅡ组的乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)值和坏死率无显著差异(p>0.05)。(2)Annexin V FITC/PI双染色检测和Hoechst33258染色检测凋亡率,发现在AngⅡ组中凋亡率最高, SKF96365+AngⅡ组的凋亡率低于AngⅡ组。这表明SKF96365能降低凋亡率。(3)剪切α-fodrin蛋白与完整α-fodrin蛋白的比值在SKF96365+AngⅡ组高于对照组而低于AngⅡ组。结论1.体外培养新生大鼠心肌细胞时,0.1μM浓度的血管紧张素Ⅱ可安全成功地诱导出心肌细胞肥大。2.血管紧张素Ⅱ诱导的肥大心肌细胞中,其TRPC1的mRNA和蛋白表达上调;阻滞TRPC可以部分抑制血管紧张素Ⅱ诱导的细胞肥大,TRPC1在心肌肥大过程中发挥十分重要的作用。3.血管紧张素Ⅱ诱导TRPC1通道高表达的机制可能为:结合AT1受体- PLC-钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子这一途径来上调TRPC1表达,并通过TRPC1自身正反馈进一步上调。4.血管紧张素Ⅱ诱导的肥大细胞因TRPC1高表达在缺氧复氧时更易发生凋亡,TRPC1通过钙蛋白酶(Calpain)参与肥大细胞凋亡。5. TRPC1有望成为一个新的干预位点,从而减轻肥大心肌缺氧复氧损伤,最终改善患者预后。