论文部分内容阅读
牙本质的形成起于颅神经嵴来源的间充质细胞，经过一系列细胞分化阶段演变为成牙本质细胞，此过程受到多种信号网络系统及转录因子和生长因子的调控。已知BMP2为牙本质发生发育所必需，DSPP是成牙本质细胞分化的重要标志物，体外实验表明BMP2对成牙本质细胞分化具有调控作用。然而，BMP2在体内牙本质发育时期尤其在生后牙本质形成过程中的具体作用尚不明确；BMP2经由何种信号转导途径调控DSPP基因表达的分子机制仍有待阐明。本研究应用BMP2条件性基因敲除小鼠模型，在体评估BMP2对生后小鼠牙本质形成的影响；并通过建立永生化成牙本质细胞样细胞株，探讨BMP2对成牙本质细胞DSPP基因转录调控的分子机制。主要研究结果如下：1.BMP2条件性基因敲除导致小鼠生后牙本质发育不全本研究应用Osx-cre小鼠模型条件性敲除牙本质中的BMP2，探讨BMP2在生后小鼠牙本质形成中的调节作用。BMP2条件性基因敲除小鼠呈现广泛而严重的异常牙齿表型并出现左右不对称和分叉的切牙。X线及Micro-CT显示切牙尖端破损，牙髓腔扩大伴牙根形成障碍。切牙和磨牙的牙本质层均变薄并伴有矿物质过少。扫描电镜分析显示牙本质表面粗糙不平，开放牙本质小管数量显著减少，大多数牙本质小管排列杂乱无序。以上结果表明BMP2为正常牙本质形成所必需。2.建立永生化成牙本质样细胞株本研究从生后第三天小鼠下颌第一磨牙原代取材培养牙乳头间充质细胞，通过转染SV40T-Ag建立永生化细胞株。转染后的细胞以RT-PCR、免疫组织化学法加以鉴定，并分析其碱性磷酸酶活性和矿化结节的形成率。在这些永生化的细胞株当中，有一株名为iMDP-3的细胞，显示出高的增殖率及分化和形成矿化结节的能力,但同时保留了与原代培养的细胞相似的基因型和表型特征。此外，iMDP-3细胞还有高的转染效率且能够为BMP2刺激所诱导并作出回应。综上我们得出结论，建立这样一种稳定的小鼠牙乳头间充质细胞株，或许能用以牙齿细胞分化和牙本质形成的机制研究。3. BMP2调控DSPP基因转录经由Dlx3-Osx-GCN5信号通路介导本研究中我们发现BMP2可通过上调iMDP-3磷酸化激酶Erk、Akt的活性诱导转录因子Dlx3，Osx和组蛋白乙酰化酶GCN5的磷酸化，进而促进三种蛋白发生核转位。利用凝胶阻滞迁移实验（EMSA）、抗体超迁移和寡核苷酸竞争抑制实验以及染色质免疫共沉淀（ChIP）实验证明Dlx3、Osx能与DSPP基因启动子上特定结合位点相互作用。进一步研究表明，过表达Dlx3和Osx可增强iMDP-3细胞中DSPP启动子转录活性。免疫共沉淀（Co-IP）结果显示Dlx3、Osx、GCN5之间存在蛋白与蛋白的相互作用。Re-ChIP实验证实GCN5可与RNA聚合酶II共同结合于DSPP启动子。Western blot及ChIP实验提示BMP2可通过GCN5乙酰化DSPP核心启动子组蛋白H3并重塑染色质。综上结果表明BMP2调控DSPP基因表达和成牙本质细胞分化经由Dlx3-Osx-GCN5号通路所介导。