论文部分内容阅读
研究背景与目的:
肿瘤的脉管系统是新一代抗癌药“攻击”的靶点。靶向肿瘤血管的治疗手段分为抑制肿瘤血管的生成(血管生成抑制剂)和破坏已经形成的血管(血管阻断剂)。血管阻断剂大多数能抑制微管聚合,选择性的作用于肿瘤血管内皮细胞,导致其变形、膨胀、从基底膜上脱落、使肿瘤血管堵塞、关闭,最终导致肿瘤细胞继发性死亡。
Combretastatin是一类天然存在的具有抑制微管聚合和抗肿瘤活性的多羟基取代二苯乙烯类化合物。代表化合物Combretastatin A4(CA4)和CA1已经分别开发成新药(CA4P和OXi4503)进入临床研究。CA4P常见的不良反应包括:心血管系统副作用(高血压、低血压、心动过速),肿瘤疼痛和淋巴细胞减少症。
对已知有药效的分子进行结构修饰是获得药效更好、毒性更低的药物的有效办法,也是新药开发的重要途径。本研究对由中科院广州化学所研发的具有知识产权的多取代二苯乙烯类化合物进行筛选,并对活性化合物M410(化学名称:(2)-3’-羟基-3,4’,5-三甲氧基二苯乙烯的水溶性磷酸酯盐)进行体内外抗肿瘤作用及其机理研究。
方法与结果:
1.二苯乙烯类化合物对肿瘤细胞的体外抗增殖活性
我们首先用MTT法测试了6个全新合成的多取代二苯乙烯类化合物的体外抗肿瘤细胞增殖活性。在所筛选的6种新化合物中,M410的抗增殖活性最强,然后依次是M317,M295;化合物M314、M330及M393的抗增殖活性不明显。M410对人结肠癌LoVo细胞抑制活性最高,72 h的IC50值为39.0±3.2 nM,然后依次为人肝癌HepG2细胞(72 h的IC50值为43.0±2.6 nM),人口腔上皮癌KB-3-1细胞(72 h的IC50值为54.3±6.6 nM),人乳腺癌MCF-7细胞(72 h的IC50值为57.7±6.0 nM),人肝癌BEL-7402细胞(72 h的IC50值为82.3±4.2nM),人肺腺癌A549细胞(72 h的IC50值为83.0±9.6 nM),人胃癌MGC803细胞(72 h的IC50值为414.1±46.9 nM)。
M410对多药耐药细胞同样具有明显的生长抑制作用。M410对KB-3-1细胞(敏感株)的IC50值为54.3±6.6 nM,对C-A120(阿霉素262倍耐药株)的IC50值为52.8±4.8 nM。M410对人T淋巴细胞白血病细胞株CCRF-CEM(敏感株)的IC50值为18.3±5.1 nM,对CCRF-VCR1000(长春新碱5166倍耐药株)的IC50值为44.5±5.7 nM,耐药倍数为2.4倍。
2.M410对HUVECs的生长抑制作用
取健康人脐带分离HUVECs进行原代培养,细胞免疫化学鉴定。MTT法测定M410对HUVECs的IC50值。不同浓度的M410处理HUVECs6 h~72 h,台盼蓝染色计数,绘制细胞生长曲线。
M410能明显抑制HUVECs生长,72 h的IC50值为17.5±1.5 nM。HUVECs生长曲线显示,随着培养时间的延长,未处理组的HUVECs呈典型的“S”曲线生长,72 h基本到达平台期。10 nM的M410的曲线下移,表明HUVECs的生长受到抑制。最高浓度40 nM的M410连续培养72 h几乎完全抑制了HUVEC的生长。
3.M410对纯化的微管蛋白及细胞内微管聚合的影响
M410属于多羟基二苯乙烯类化合物,极有可能和它的母体CA4一样具有微管蛋白结合能力,所以我们用比色法检测M410对纯化的牛脑微管蛋白聚合活性的影响。将对照或含待检测化合物的纯化微管蛋白溶液加入冰上预冷的比色杯中,在分光光度计340 nm下调零后,将比色杯用37℃恒温水浴保温,最初2 min每30 sec测定一次OD值,之后每5 min测定一次。直到第50 minOD不再明显上升止。分别绘制微管蛋白聚合曲线。计算化合物对微管蛋白聚合的抑制率。结果发现,M410能明显抑制微管蛋白聚合,其抑制作用与秋水仙碱类似。第50 min,M410(8μM)对微管蛋白聚合的抑制率为53.7%,秋水仙素(8μM)为57.4%。
我们进一步用细胞免疫荧光法观察M410对HUVECs细胞内微管的作用。细胞经固定、透化处理后封闭,依次与微管蛋白抗体及相应的FITC标记的二抗孵育一定时间,激光共聚焦显微镜下观察。经20 nM M410处理4h后,HUVECs胞内微管解聚,细胞骨架紊乱、瓦解,细胞萎缩,形状趋于变圆。延长处理时间和加大处理浓度使上述变化更为明显。
我们还探讨了M410对LoVo细胞内微管的解聚作用。细胞免疫荧光结果显示,未处理组LoVo细胞伸展充分,细胞形状呈不规则长梭形。经80nM M410处理24 h后,LoVo细胞内微管解聚,细胞形状趋于变圆。延长处理时间和加大处理浓度使上述变化更为明显。
4.M410对HUVECs及LoVo细胞的细胞周期影响
微管是构成细胞有丝分裂的一些结构比如纺锤体、中心粒等的重要组分。微管蛋白结合剂极有可能影响细胞周期分布。所以我们用流式细胞仪分析M410对HUVECs细胞周期分布的影响。收集不同浓度M410处理的HUVECs,PBS洗涤,70%乙醇固定。离心悬浮细胞于PBS,溴化丙啶(PI)染色后,流式细胞仪检测DNA含量,LYSIS软件分析。40 nM的M410作用HUVECs24h后,和对照组相比,细胞出现明显的G2/M期阻滞;延长作用时间至48h,20 nM的M410同样能诱导HUVECs产生明显的G2/M期阻滞。
为了进一步细分M410诱导的周期阻滞是产生在G2期还是M期,我们利用Giemsa染色观察有丝分裂阻滞。收集HUVECs,固定后离心并重悬,滴加于载玻片上,Giemsa染液浸染15 min,晾干后于显微镜下观察。不同浓度M410分别处理HUVECs24h,细胞呈现明显的有丝分裂阻滞。细胞核膜消失,染色体深染且松散分布于胞浆中。
M410同样能诱导LoVo细胞产生G2/M期阻滞。M410处理LoVo细胞48h后,中剂量组80 nM的G2/M期细胞百分比为59.1±4.8%,高剂量组160 nM的G2/M期细胞百分比为71.1±8.6%,而未处理组的为8.9±0.3%。
5.M410对HUVECs迁移的影响
我们已经证实M410对HUVECs的生长抑制作用,对M410是否能抑制HUVECs的迁移能力同样很感兴趣。利用Transwell侵袭实验,我们观察到5 nM的M410处理6h已经能明显抑制HUVECs迁移,抑制率为65.4%(P<0.01),20 nM的抑制率86.7%(P<0.01)。
6.M410对LoVo结肠癌移植瘤的抑瘤效果
7.M410对HepG2肝癌移植瘤的抑瘤效果
8.M410降低LoVo细胞核内HIF-1α含量
9.M410降低LoVo细胞VEGF mRNA水平
结论:
1.在新合成的多取代二苯乙烯类化合物中,以(Z)-3’-羟基-3,4’,5-三甲氧基二苯乙烯的水溶性磷酸酯盐(M410)体外抗肿瘤细胞增殖活性最高。M410能明显抑制LoVo结肠癌等肿瘤细胞生长。
2.M410对P-gp过度表达或者Topo II活性低的多药耐药肿瘤细胞同样有效。
3.M410能明显抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生长,并能抑制HUVEC迁移。
4.M410抑制体外纯化的微管蛋白聚合。在HUVEC细胞中,M410能快速使细胞内微管解聚,改变细胞形态,诱导有丝分裂阻滞。M410与大多数血管阻断剂的作用靶点和作用方式是一致的。
5.M410能使LoVo细胞胞内微管解聚,并诱导LoVo细胞产生G2/M期阻滞。
6.M410在体内抑制LoVo结肠癌和HepG2肝癌移植瘤的生长,使肿瘤组织血管数目减少。提示M410的体内抗肿瘤作用可能与其血管阻断作用有关。
7.M410能下调HIF-1α的蛋白水平,减少核内HIF-1α的含量,并下调VEGFmRNA水平。表明M410具有抑制血管生成的潜力。
8.M410有可能发展成为具有抗肿瘤细胞增殖活性、抑制血管生成和破坏肿瘤血管的新型的血管阻断剂,并具有发展成为多靶点的新型抗肿瘤药物的潜能。