论文部分内容阅读
轮纹病(Botryosphaeria dothidea)在我国是危害严重的苹果主要病害之一。研究苹果植物的抗病机制并在此基础上培育抗病品种是有效地防治苹果病害的重要途径之一。本研究通过鉴定苹果轮纹病防御相关基因并研究其功能,以探索苹果植物对轮纹病的防御机制。参照模式植物,对苹果基因组中的防御相关基因进行生物信息学分析,并结合利用半定量RT-PCR和荧光定量PCR技术,发现6个响应轮纹病病原菌侵染的基因,包括甘露糖结合蛋白基因MdMBP2.酰基辅酶A结合蛋白基因MdACBP2.2个病原相关蛋白PR-4基因MdPR-4-1和MdPR-4-2、水稻CBiP基因的同源基因MdCBiP1以及西红柿抗性基因Cf4的同源基因MdCf3。其中MdMBP2、MdPR-4-1、MdPR-4-2、MdCBiP1、MdCf3在轮纹病病原菌侵染后表达量显著上升,而MdACBP2的表达则在轮纹病病原菌侵染后显著下降。本研究首先对3个差异达到极显著水平的基因MdPR-4-1、MdMBP2、MdACBP2进行了功能分析。MdPR-4-1基因编码PR-4蛋白但缺少几丁质结合结构域。B.dothidea侵染、水杨酸及茉莉酸甲酯处理能使该基因表达上调,而DIECA处理抑制其表达；体外分析表明,重组的苹果MdPR-4-1蛋白具有以单链RNA为底物的核糖核酸酶活性,这种酶活性能被5’-ADP所抑制。MdPR-4-1蛋白还对苹果轮纹病、腐烂病、炭疽病病原菌有显著的抑菌活性,这种抑菌活性与其核酸酶活性相关。MdMBP2基因编码的蛋白质包含B-lectin结构域和PAN-apple结构域,与葡萄和大豆的表皮分泌蛋白(EP)及拟南芥的甘露糖结合蛋白具有较高的序列相似性,属B-lectin家族Class Ⅰ。荧光定量PCR分析显示,MdMBP2基因在皮和叶中的表达量较高,B.dothidea侵染能诱导MdMBP2转录本的积累,且其时序表达变化与轮纹病发病过程相关,暗示该基因参与了苹果抗轮纹病的防御反应。体外试验表明,MdMBP2蛋白能与真菌细胞壁组分甘露寡糖和高甘露糖型聚糖有较高的结合活性,表明MdMBP2蛋白可能参与病原真菌的识别。MdACBP2编码酰基辅酶A结合蛋白,序列和结构特征表明该基因是ACBP家族Class Ⅰ亚族的成员。荧光定量PCR分析显示,MdACBP2在叶中的表达量最高,在幼果中的表达量最低。不同胁迫处理的时序表达分析表明,MdACBP2的表达能被B.dothidea侵染和10%PEG渗透胁迫所抑制,低温胁迫则能诱导MdACBP2的表达,1mmol·L-1Pb(NO3)2处理对MdACBP2的表达没有显著影响。推测MdACBP2可能参与了苹果对低温胁迫的防御反应。本研究表明,(?)MdPR-4-1、MdMBP2基因均参与了苹果植物对轮纹病病原菌的防御反应,MdPR-4-1编码抗菌蛋白,通过直接抑制病原菌的生长来抵御轮纹病病原菌的侵染；MdMBP2则可能编码识别蛋白,通过参与对病原真菌的识别参与防御反应。MdACBP2基因的表达能被轮纹病病原菌侵染所抑制,其与苹果植物对轮纹病防御反应之间的关系还需要进一步研究,不同胁迫处理的结果表明该基因能被B.dothidea侵染和10%PEG渗透胁迫所抑制,但能被低温处理诱导表达,推测该基因可能参与了苹果植物对生物或非生物胁迫的抗性反应。