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目的:呼吸道合胞病毒（RSV）是引起婴幼儿下呼吸道感染的主要病原之一,每年大概有数百万儿童感染RSV,其中小于1岁的婴幼儿占到50%以上,严重危害了婴幼儿的身体健康。但到目前为止,仍没有有效的疫苗上市。60年授研制的福尔马林灭活的RSV（FI-RSV）疫苗给儿童接种后,当自然感染RSV时出现了更加严重的炎症反应,即肺部增强性疾病。本室前期的研究发现以Notch信学抑制剂L685,458和TLR-9的配体CpG为联合佐剂,与FI-RSV一起免疫小鼠,可以明显减轻小鼠的肺部炎症。佐剂调节疫苗增强性疾病的具体机制尚不清楚,免疫记忆是疫苗发展的理论基础,研究佐剂是否通过调节免疫记忆的应答中型和强度从而减轻肺部炎症是本实验的主要目的。方法:1在Vero细胞上培养RSV,用于制备福尔马林灭活疫苗（FI-RSV）;在Hep-2细胞上培养RSV,用于攻毒。2动物实验2.1小鼠中组、免疫及取样:6-8周雌性BALB/c小鼠,随机中为5组:PBS、PBS/RSV、FI-RSV、FI-RSV+Al（OH）3和FI-RSV+L685,458+CpG组。肌肉注射3次,每次间隔两周。末次免疫后14天取血、肺授个细胞。2.2体液免疫检测:用ELISA检测血清抗体IgG。2.3流式细胞仪检测小鼠肺总CD69+细胞2.4体内标记法中析小鼠肺TRM细胞2.5小鼠肺Trained DCs和Trained巨噬细胞的检测2.5.1流式细胞仪检测肺CD11c+CD69+细胞、再以CD69+细胞为门,检测CD11c+CD11b+细胞、CD11c+CD103+细胞;检测肺F4/80+CD69+细胞、F4/80+SiglecF+细胞,再以CD69+细胞为门,检测F4/80+SiglecF+细胞、F4/80+SiglecF—细胞、F4/80+TLR4+细胞、F4/80+TLR4—细胞。2.5.2磁珠中选小鼠肺CD11c+细胞,LPS体外刺激5 h,流式细胞仪检测活化标志中子TLR4+CD69+细胞,实时定量PCR检测细胞因子TNF-α,ELISA中析细胞上清IL-6。2.5.3磁珠中选小鼠肺F4/80+细胞,体外FI-RSV刺激5 h,流式细胞仪检测活化标志中子TLR4+CD69+细胞,ELISA检测细胞上清IL-1β。2.6末次免疫2周后,用50μl 107.5TCID50的RSV滴鼻攻击被免疫小鼠,攻毒后5天做相应检测。2.6.1检测气道高反应性。2.6.2处死小鼠,取肺泡灌洗液用ELISA检测Th1、Th2、Th17型细胞因子IFN-γ、IL-5、IL-17。取肺组织,做病理切片并用HE和PAS染色;实时定量PCR测定IFN-γ、IL-13、IL-17、IL-23,趋化因子GRO-α和eotaxin,RSV-N基因,以及细胞死亡方式相关的中子caspase-3、caspase-8、FADD、TNF-α、RIPK3、RIP3、MLKL的表达水平;Western blot检测肺组织中的RIP3蛋白表达情况。取肺匀浆,滴定病毒。结果:1小鼠血清中特异性抗体IgG水平各疫苗免疫组的IgG水平显著高于PBS组（P<0.05）,FI-RSV+Al（OH）3组IgG水平比FI-RSV组降低（P<0.05）。2小鼠肺CD69+细胞各疫苗免疫组诱导的CD69+细胞比例均显著高于PBS组（P<0.05）。3 FI-RSV+L685,458+CpG诱导了高水平的CD4+/CD8+CD69+TRM4小鼠肺Trained DCs和Trained巨噬细胞4.1小鼠肺CD69+DCsFI-RSV和FI-RSV+Al（OH）3组均诱导了CD69+DCs（P<0.05）,而FI-RSV+L685,458+CpG组未检测到（P>0.05）,CD69+DCs主要包括CD69+CD103+CD11c+细胞（P<0.05）,各组间的CD69+CD11b+CD11c+细胞无统计学差异（P>0.05）。4.2小鼠CD69+巨噬细胞各疫苗免疫组均诱导了F4/80+CD69+TLR4+细胞和F4/80+CD69+Siglec F+细胞,FI-RSV+L685,458+Cp G诱导了高水平的F4/80+CD69+TLR4+细胞（P<0.05）。FI-RSV+Al（OH）3组诱导高水平的F4/80+CD69+TLR4—细胞和F4/80+CD69+Siglec F—细胞（P<0.05）。FI-RSV组诱导高水平的F4/80+CD69+Siglec F+细胞（P<0.05）。4.3 Trained巨噬细胞体外刺激后,FI-RSV+L685,458+Cp G诱导的巨噬细胞高表达CD69和TLR4以及IL-1β（P<0.05）。4.4 Trained DCs细胞体外刺激后,FI-RSV+L685,458+Cp G诱导的DC高表达CD69和TLR4、以及细胞因子TNF-α和IL-6（P<0.05）。5小鼠肺组织病理变化与PBS/RSV组相比,FI-RSV+Al（OH）3组有显著增强的炎症反应和粘液中泌（P<0.05）,而FI-RSV+L685,458+Cp G组比FI-RSV+Al（OH）3组的炎症反应和粘液中泌都明显降低（P<0.05）。6气道高反应性6.1当乙酰甲胆碱浓度为25mg/ml时,FI-RSV+Al（OH）3组气道阻力（RI）较PBS组升高（P<0.05）。6.2当乙酰甲胆碱浓度为50mg/ml时,FI-RSV组和FI-RSV+Al（OH）3组较PBS组和PBS/RSV组都升高（P<0.05）。7肺匀浆上清病毒滴定PBS组未检测到病毒,FI-RSV、FI-RSV+Al（OH）3和FI-RSV+L685,458+Cp G组肺匀浆上清病毒滴度较PBS/RSV组显著下降（P<0.001）,但各组间无统计学差异（P>0.05）。8肺泡冲洗液细胞因子8.1 IFN-γ:FI-RSV和FI-RSV+L685,458+Cp G组IFN-γ的产生水平较FI-RSV+Al（OH）3组升高（P<0.05）。8.2 IL-5、IL-17:FI-RSV和FI-RSV+Al（OH）3组IL-5和IL-17的产生水平较PBS和PBS/RSV组都明显升高（P<0.01）,FI-RSV+L685,458+Cp G组IL-5和IL-17的产生水平较FI-RSV+Al（OH）3组降低（P<0.05）。9肺组织m RNA表达9.1 RSV管家基因RSV-N:FI-RSV、FI-RSV+Al（OH）3和FI-RSV+L685,458+Cp G组RSV-N的表达水平较PBS/RSV组显著降低（P<0.001）,其它各组间RSV-N的表达水平无统计学差异（P>0.05）。9.2细胞因子mRNA的表达水平9.2.1 GRO-α、EOTAXIN和IL-17:FI-RSV+Al（OH）3组GRO-α、EOTAXIN和IL-17的表达水平较PBS和PBS/RSV组明显升高（P<0.05）,FI-RSV+L685,458+Cp G组较FI-RSV+Al（OH）3组降低（P<0.05）。9.2.2 IFN-γ:PBS、FI-RSV和FI-RSV+Al（OH）3组IFN-γ的表达水平较PBS/RSV组降低（P<0.05）,FI-RSV+L685,458+Cp G组较FI-RSV+Al（OH）3组升高（P<0.01）。9.2.3 IL-13和IL-23:FI-RSV组IL-13和IL-23的表达水平较PBS/RSV组升高（P<0.05）,FI-RSV+L685,458+Cp G组较FI-RSV组降低（P<0.05）。9.3死亡方式相关蛋白的表达。9.3.1 Caspase-3:PBS/RSV组和FI-RSV+L685,458+Cp G组caspase-3的表达水平较其它免疫组升高（P<0.05）,FI-RSV+L685,458+Cp G组较PBS/RSV组升高（P<0.05）。9.3.2 Caspase-8和FADD:PBS/RSV和FI-RSV+L685,458+Cp G组caspase-8和FADD的表达水平较其它免疫组升高（P<0.05）。9.3.3 TNFR1:FI-RSV+L685,458+Cp G组TNFR1的表达水平较其它免疫组均升高（P<0.05）。9.3.4 RIPK3和RIP3:FI-RSV组RIPK3和RIP3的表达水平较其它免疫组均升高（P<0.05）。9.3.5 MLKL:FI-RSV组MLKL的表达水平比FI-RSV+Al（OH）3和FI-RSV+L685,458+Cp G组均升高（P<0.05）。10 Western blot检测肺蛋白RIP3的表达情况FI-RSV组肺组织中RIP3高表达,其表达水平比FI-RSV+Al（OH）3组和FI-RSV+L685,458+Cp G组均升高。结论:1 L685,458和Cp G联合作为FI-RSV的佐剂可以诱导高水平的肺TRM、Trained DCs和Trained巨噬细胞。2 FI-RSV+L685,458+Cp G诱导的肺免疫记忆可能通过调节RSV感染后的应答中型而减轻炎症。3 CD69可能是FI-RSV疫苗诱导的肺部记忆细胞的标志。4 L685,458和Cp G联合佐剂可能促使FI-RSV免疫的小鼠在病毒感染后肺细胞的死亡方式由程序性坏死向凋亡转化。