隐孢子虫是重要的人畜共患机会性致病原虫,全球范围内广泛流行,主要通过粪口途径传播。目前针对隐孢子虫的检查手段主要有显微镜检查、免疫学检查、分子生物学检查等方法。以PCR为代表的分子生物学检测方法需要被检样品较为洁净的核酸物质作为反应模板,因此获取纯度较高的样品DNA对于PCR扩增至关重要。FTA卡是基于干血点技术的一种商业化产品,世界范围内广泛用于各类病原微生物核酸物质的快速获取。目前FTA/PCR法检测隐孢子虫卵囊的研究只在水源性隐孢子虫中有所开展。本研究旨在建立FTA/PCR检测粪便中隐孢子虫的方法,并与市售商业化粪便DNA提取试剂盒比较DNA提取效果,为研制新的检测粪便中隐孢子虫卵囊的方法奠定基础。使用不连续密度Sheater’s糖梯度离心、CsCl密度梯度离心等纯化方法,共获得纯化的隐孢子虫卵囊1.56×10~8个,经gp60基因位点鉴定隐孢子虫卵囊亚型为IIdA19G1。基于隐孢子虫SSU rRNA基因位点,建立了FTA/PCR检测纯化后隐孢子虫卵囊的方法,该方法最低检测限为1×10~1个卵囊/mL。使用设计的特异性引物对隐孢子虫、环孢子虫、贾第虫、球虫进行检测,结果显示该方法仅能检测出隐孢子虫卵囊,表明该方法具有很好的特异性。基于SSU rRNA基因位点,从预处理粪便样品、净化DNA模板、优化PCR引物、优化PCR反应条件等方面,建立了对粪便中隐孢子虫卵囊进行检测的FTA/PCR方法。通过对粪便样品进行饱和蔗糖漂浮、裂解破壁、化学试剂和离子去污剂清洗、设计特异性引物序列等试验,确定了以5%SDS(十二烷基磺酸钠)溶液煮沸FTA卡5 min,并结合Whatman公司提供的FTA卡常规洗脱步骤的清洗方法,采用基于SSU rRNA基因位点片段长度为540 bp和250 bp的隐孢子虫引物,并在巢式PCR反应中加入BSA(犊牛蛋白血清)的FTA清洗方法和PCR扩增程序。通过上述方法得到FTA/PCR检测粪便中隐孢子虫卵囊的最低检测限为1×10~1个卵囊/mL,其特异性检测显示该特异性引物只能扩增出隐孢子虫目的条带,对测序结果与隐孢子虫标准序列比对显示,其同源性为100%。利用FTA卡和市售商业化粪便DNA提取试剂盒,对郑州中牟地区某奶牛养殖场通过直肠采样的方式采得的72份奶牛粪便样品进行隐孢子虫卵囊的DNA提取,并通过巢式PCR进行分子生物学检测。结果显示:通过FTA/PCR法72份样品中共检出18份隐孢子虫阳性样品,感染率为25.35%。这一检测结果同市售商业化试剂盒提取隐孢子虫卵囊DNA后进行PCR扩增结果一致。综上所述,本研究建立了检测粪便中隐孢子虫卵囊的FTA/PCR方法,该方法特异性强,敏感性为1×10~1个卵囊/mL。田间样品检测显示,该方法检测效果与市售商业化试剂盒一致。本研究建立了提取粪便中隐孢子虫卵囊DNA的新方法,为开发建立FTA/PCR方法检测试剂盒奠定了基础。