新陈代谢是生命活动的基础,是生命活动最重要的特征,酶是能够催化自然界中各种反应的大分子生物催化剂,在新陈代谢中起重要作用.在本研究中,我们集中研究了这样的酶,他们分别参与(a)檀香烯合成(檀香烯是天然名贵香料檀香油主要成分的前体化合物)和(b)牛磺酸的代谢(牛磺酸是一种和人类健康疾病息息相关的的重要氨基酸).　　(a)檀香烯合成:萜类化合物,分子式为异戊二烯单位倍数的烃类及其含氧衍生物,主要由异戊烯基焦磷酸(IPP)和烯丙基焦磷酸(DMAPP)为基本单元组成,根据重复基本单元数目的不同,萜类化合物可以分为单萜(C10),倍半萜(C15)和二萜(C20)等.单萜类化合物是指分子中含有两个分子异戊二烯单元的烯萜及其衍生物,如薄荷醇;倍半萜类是指由三分子异戊二烯聚合而成,分子中含有15个碳原子的天然萜类化合物,如金合欢烯,青蒿素;二萜类化合物可以看成是由四分子异戊二烯聚合而成分子中含有20个碳原子的天然萜类化合物,如丹参酮,紫杉醇.萜类化合物的合成涉及萜类合酶的催化活性,以及下游的去饱和酶,细胞色素P450酶,乙酰转移酶等进行的氧化还原、羟化、乙酰化等修饰,因此,萜类化合物是自然界中最丰富,结构最多样化的天然产物之一.萜类化合物在生物体内发挥着重要的生理功能,比如抗疟药青蒿素,抗癌药紫杉醇,抗氧化作用的胡萝卜素和番茄红素以及天然名贵香料檀香油等.　　萜类合成酶在自然界萜类化合物的合成中起着重要作用,它可以催化线性非手性类异戊二烯单元向各种萜类烯烃的转化.许多萜类合成酶都有产物多样性的特点,利用同一种底物,能够同时产生数百种结构上和立体化学上相似但不同的产物.传统的方法依赖于气相色谱和质谱联用(GC-MS)或液相色谱和质谱联用(LC-MS)来检测萜类合成酶的产物,并根据各种产物的总量计算酶促动力学常数,但是这种色谱质谱偶联的方法经常会伴随着复杂不均一的洗脱峰,对于一些产量较低的产物,依靠这种方法很可能会导致产物的检测缺失.此外,要用色谱进行准确可靠的定性和定量往往需要标准品的校正,由于分离提取工艺的限制以及某些萜类化合物不稳定的特性,很多萜类化合物的标准品在市面上不能轻易获得.这里,我们提供了一种利用酵母来源的无机焦磷酸酶(IPP1)偶联的显色方法表征萜类合酶,所有的萜类合成酶在催化特异的底物生成相应的产物时都会释放出一个焦磷酸,在偶联反应体系中,释放出的焦磷酸可以被IPP1催化生成两个正磷酸,正磷酸在硫酸亚铁还原剂存在的情况下可以和钼酸铵反应形成在波长660纳米处有特异吸收的磷钼酸复合物,通过定量萜类合酶的副产物焦磷酸的含量,确定产生萜类化合物的总量,从而确定萜类合酶的酶促动力学常数.　　作为IPP1偶联显色方法的证明,我们选择檀香烯合酶进行显色反应的表.首先,我们通过聚合酶链式反应(PCR)、酶切、链接、GibsonAssembly等分子克隆手段,构建用于表达三种檀香烯合酶和无机焦磷酸合酶(IPP1)的质粒骨架,经过验证得到正确的基因序列后,分别将这四种质粒转化到大肠杆菌中进行蛋白质的表达纯化.在得到足够的用于显色反应的三种檀香烯合酶后,参照文献,用传统的GC-MS的检测方法对它们进行定性,验证得到的酶在体外反应中有活性.IPP1作为檀香烯合酶显色反应的下游偶联酶,为了保证所加酶量具有足够的催化上游檀香烯合酶释放出的焦磷酸的能力,在做显色反应之前,先测定IPP1的催化活性.　　然后设计实验进行显色反应:通过查阅相关文献资料,配置显色液,分别建立显色反应的磷酸和焦磷酸标准曲线,两条显色反应标准曲线的斜率刚好是二倍关系,表明了溶液中的焦磷酸被IPP1完全催化形成磷酸并和显色液显色.与此同时,我们利用碱性磷酸酶(CIP)进行显色反应,测定底物FPP的实际浓度.在反应体系中加入足量的底物,以保证檀香烯合酶最快的催化反应速度,测定不同反应时间和不同酶量条件下,每摩尔檀香烯合酶每分钟可以催化多少微摩尔的底物变成产物,平行测定三次,两种不同条件下测得的结果吻合,从而确定檀香烯合酶kcat值.在测定檀香烯合酶的酶促动力学常数时,采用冻干浓缩的方法富集产物焦磷酸,偶联IPP1进行显色,得到三种酶的kcat和Km值.　　最后,为了证明IPP1偶联显色方法的可靠性,将这种方法与传统的GC-MS方法结合.檀香烯的标准品在市面上不能获得,通过设计引物,进行PCR反应,利用酶切、连接、GibsonAssembly等分子克隆手段构建檀香烯合酶SanSyn的pACYC的质粒骨架,转化到优化过的酿酒酵母Santa1.0中进行表达.参照相关文献,利用两相发酵系统发酵表达alpha檀香烯,用蒸馏、薄层色谱等方法分离纯化得到檀香烯标准品,以降冰片二烯为内标,采用核磁共振氢谱(H1NMR)对得到的标准品进行定量.最后,设计实验把其中一种檀香烯合酶SaSSy的催化反应产物的GC-MS结果和显色结果对应,证实显色反应的可靠性.先将纯化得到的alpha檀香烯标准品用含有一定量蛇麻烯humulene的正己烷稀释到一系列不同浓度,建立GC吸收峰面积和alpha檀香烯浓度的标准曲线,humulene起到校正进样针进样误差的作用.设计实验在一个反应体系里同时进行两种反应,上层有机相萃取檀香烯合酶催化底物FPP产生的alpha檀香烯,并进行GC-MS检测定量,下层水相偶联IPP1进行显色反应定量檀香烯合酶催化底物FPP产生的焦磷酸.　　无机焦磷酸偶联的显色反应通过浓缩反应混合液,检测产生的总焦磷酸的含量测定酶的活性,这种方法可以广泛适用于所有萜类合酶的活性检测,并且这种方法操作简单、方便快捷,成本低廉,可用于高通量筛选.　　(b)牛磺酸的代谢:人体肠道微生物是包括细菌,酵母菌,真菌和病毒的复杂群落,它由大约100万亿个微生物组成并且包含人体中所有微生物的70%以上,肠道微生物群与人类健康和疾病密切相关.人类肠道中微生物聚生体对食物和宿主衍生化合物的化学转化对我们的健康有着深刻但鲜为人知的影响.尽管碳和氮大部分发酵为无害气体和有机酸,但硫转化为有毒气体硫化氢,其已经涉及炎症,结肠直肠癌和其他疾病.人类肠道中硫的主要来源是牛磺酸,它是哺乳动物细胞中的关键渗透物质,也是人体内含量最丰富的氨基酸之一.牛磺酸没有被纳入到蛋白质序列中,它没有氨基酸的经典结构,但牛磺酸在中枢神经系统中具有广泛的功能,并且与糖尿病,细胞保护,心肌病,肾功能障碍,发育异常等疾病息息相关.牛磺酸降解的丰富酶学已经在过去五十年中得到研究,在硫酸盐和亚硫酸盐还原菌(SSRB)中,牛磺酸通过氨基转移酶牛磺酸-丙酮酸转氨酶(TPA)或牛磺酸-2-酮戊二酸氨基转移酶(TOA)转化为磺酸乙醛,并随后通过磺酸乙醛乙酰转移酶Xsc释放亚硫酸盐还原成硫化氢.　　在这里,我们发现了一种新的牛磺酸降解途径,存在于肠道厌氧微生物群落中,涉及通过由氧气敏感的甘氨酸自由基酶(GRE)催化的"自由基化学"的前所未有的C-S键切割机制.我们的研究动机是未知甘氨酸自由基酶(GUF)的表征,此未知功能的甘氨酸自由基酶广泛存在于SSRB中,并与已知转运有机酸和脂肪族磺酸盐的TRAP转运蛋白有关.因此,我们假设GUF作用于羟乙磺酸盐,并从模型硫酸盐还原菌Desulfovibrio vulgaris中重组生产GUF及其相邻的激活酶,通过实验证实此酶确实是羟乙磺酸盐磺酸裂解酶,并将它及其激活酶分别命名为IseG和IseH.课题组利用生物信息学技术发现IseG在不同物种中的存在,包括几乎所有的硫还原菌,和一些梭菌Clsotridum.在人肠道菌Clostridium butylricum中发现IseG,IseH与编码牛磺酸ABC转运蛋白的酶的基因相邻,同一操纵子内还含有编码一个金属依赖乙醇脱氢酶家族的酶和一个转氨酶的基因.课题组提出牛磺酸经转氨酶作用产生磺酸乙醛,再经该脱氢酶作用产生羟乙磺酸,进而被IseG催化产生乙醛和亚硫酸,Clostridium利用这一通路进行同化作用获得碳和硫.通过克隆表达纯化这一系列酶,在体外证实了这一假说.首先,通过基因合成、分子克隆等手段构建Bacillus subtilis来源的丙氨酸脱氢酶,Clostridium来源的转氨酶和脱氢酶的质粒骨架,将它们分别转化到大肠杆菌中进行表达和纯化.丙氨酸脱氢酶(BsAlaDH)作为转氨酶的偶联酶,催化L-丙氨酸形成丙酮酸和氨的可逆的氧化脱氨反应,并伴有NAD+到NADH的转化,通过使用分光光度计测量在340纳米处的吸光度变化可以检测其催化活性.然后,通过偶联转氨酶和丙酮酸脱氢酶,分别与底物丙酮酸和alpha酮戊二酸反应,检测在340纳米处吸光度的变化确定Clostridium来源的转氨酶是TPA而不是TOA.最后,脱氢酶的活性检测,由于我们推测的脱氢酶的底物磺酸乙醛在市面上不能获得,所以,设计实验将脱氢酶偶联转氨酶TPA在同一个反应体系里进行反应,转氨酶的产物作为脱氢酶的底物,脱氢酶在催化过程中会有NADH到NAD+的变化,通过检测在340纳米处吸光度的降低验证该酶是否具有催化活性,该脱氢酶是NADH依赖的磺酸乙醛还原酶,由于它的活性之前从未被报道过,所以我们把这一全新的酶命名为为TauF.　　IseG,TauF是很多肠道细菌中目前已知唯一的牛磺酸代谢途径,IseG,TauF途径的发现,是人类最重要的氨基酸之一牛磺酸基础代谢的一个突破,不仅解析了这些硫还原菌如何进行呼吸作用的关键谜团,也在酶学上提供了一个新的催化机理.在应用上,随着通路中IseG,TauF这些酶的发现,为控制益生菌与致病菌的比例,体内有毒分子硫化氢的含量等提供了精准的靶点.