致病性微生物引起的食品安全问题日益严重,严重影响人们的身体健康和生活质量。开发高效、安全、稳定的乳酸菌细菌素作为天然防腐剂代替化学防腐剂,是目前亟待解决的科学问题。乳酸菌是国际公认的安全菌株（GRAS）,乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的多肽、蛋白质或蛋白质复合物,可以有效抑制革兰氏阳性菌和部分致病菌的生长繁殖。本课题组从内蒙、黑龙江、河北等地的发酵乳制品中分离出的60多株乳酸菌中筛选出1株抑菌活性较强的乳酸菌,其细菌素合成能力和抑菌效果具有明显优势。但由于细菌素提纯步骤复杂,对细菌素生物学特性和抗菌机制的研究受到限制。因此,本研究通过大肠杆菌异源表达重组细菌素,主要分以下几个部分:1.菌株鉴定和原核表达载体构建,2.重组细菌素大肠杆菌异源表达和纯化,3.重组细菌素抗菌特性,4.重组细菌素抗菌机制,为促进干酪乳杆菌细菌素的工业应用提供支持。通过菌落形态学观察、生理生化测定、16S rDNA测序以及pheS看家基因扩增,鉴定实验菌株为干酪乳杆菌。排除有机酸和过氧化氢的以及蛋白酶敏感性实验,确定抑菌作用是由细菌素产生。应用PCR扩增方法筛选出干酪乳杆菌细菌素编码基因LacA和LacB,在此基础上,采用重叠延伸PCR技术（SOE-PCR）获得两端带有酶切位点的重组细菌素基因。将扩增产物连接到pMD18-T载体上,构建克隆质粒pMD18-T-LacAB和原核表达载体pGEX-4T-1-LacAB。选用大肠杆菌异源表达重组细菌素,进一步研究重组细菌素的抗菌特性以及抗菌机制。将重组表达质粒pGEX-4t-1-LacAB转入到大肠杆菌TOP10,经IPTG诱导后,并在大肠杆菌中成功表达。经SDS-PAGE分析显示,诱导产生的GST融合蛋白为可溶性。经GST融合蛋白纯化试剂盒纯化GST-LacAB,然后用凝血酶切割,再经纯化获得单一LacAB蛋白,蛋白含量是1.85 mg/mL。采用牛津杯琼脂扩散法检测纯化的重组细菌素LacAB抗菌活性,结果显示对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用,抑菌圈直径分别为12.15、10.57mm。优化诱导表达条件（诱导温度、诱导时间、IPTG浓度、表达菌株）,以确定最佳IPTG诱导表达条件为:诱导温度为30°C、IPTG浓度为0.8mmol/L,诱导表达时间为3h,大肠杆菌BL21表达菌株。抑菌活性分析,纯化后重组细菌素对不同来源指示菌抑菌活性分析表明,干酪乳杆菌细菌素抑菌谱广,不仅对革兰氏阳性菌致病菌金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、李斯特菌具有明显的抑制作用,对部分革兰氏阴性致病菌大肠杆菌、沙门氏菌等也具有明显的抑制作用。纯化重组细菌素的稳定性研究表明,重组细菌素具有较强的热稳定性,耐酸碱稳定性、耐冻融稳定性、表面活性剂（SDS、吐温-20、吐温-80、尿素、曲拉通X-100）对细菌素抑菌活性无影响,EDTA可以增强抑菌作用。纯化后的细菌素对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为62.5μg/ml和125μg/ml。运用生物信息学对LacA和LacB氨基酸序列进行系统分析,依照分析结果对其进行分子改造。重组细菌素由LacA和LacB组成,属于细菌素Class Ⅱ类型。预测蛋白质结构及功能,包括蛋白质理化性质、蛋白质二级结构和三级结构预测、跨膜区域、信号肽等特征,结果显示LacA和LacB的结构具有细菌素Class Ⅱ的结构特征,根据细菌素Class Ⅱb的GxxxG活性位点,设计氨基酸定点突变位点是LacA蛋白中第40位V和第57位Ⅰ。构建突变载体,分析突变体的抗菌活性,结果表明,两个位点中任何一个氨基酸位点发生改变都明显影响细菌素的抗菌活性,推测这两个位点有可能是干酪乳杆菌细菌素发挥抑菌活性的关键氨基酸位点。