荧光共振能量转移(FRET)是两个荧光分子间的一种非放射性的能量转移形式,由于FRET产生时对两个荧光基团间的距离的强烈依赖性,因而特别适用于在活细胞中检测分子间或者分子内的相互作用。基于光学显微镜平台的荧光共振能量转移技术已被广泛地应用于活细胞内蛋白质时空相互作用的检测、蛋白质分子构象变化的监测、生物探针的研制等研究中。为了更好地研究活体内蛋白质的时空相互作用,我们基于Olympus IX-81倒置荧光显微镜自行搭建了用于活细胞成像的三通道荧光共振能量转移技术显微镜成像平台。基于此平台,我们运用青绿色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)定量测定了系统中的荧光渗漏系数。利用蛋白相互作用阳性对照CFP-YFP嵌合体,和蛋白相互作用阴性对照CFP和YFP,我们根据敏化FRET测量方法(Sensitized-emission FRET)定量测定了该系统在蛋白相互作用检测上的可行性。研究结果表明,我们成功搭建了活细胞三通道荧光共振能量转移技术显微镜平台,并成功利用敏化FRET测量方法定量检测了阳性和阴性对照的蛋白质相互作用活细胞FRET荧光信号。三通道敏化FRET测量方法在活细胞蛋白质相互作用检测方面虽然有巨大优势,但也有其致命的弱点,比如荧光供受体在光谱学上的窜扰,以及活细胞中荧光供体和荧光受体的摩尔比例的不同会造成活细胞中局部荧光分布的异质性,这种异质性很大程度上影响了集群FRET (ensemble FRET)信号的定量测量。为了探寻荧光供受体的化学计量(Stoichiometry)对定量FRET测定上的影响,从而为一些经典敏化FRET检测公式确定合适供受体比例的适用范围,我们利用c-Fos/c-Jun为异源蛋白相互作用数学模型,定量研究了不同供受体比例对经典敏化FRET检测公式在FRET测定及计算上的影响。我们首先通过阳性对照CFP-YFP建立了分子内FRET数学模型,并以此测定了显微镜G参数,之后基于测定的G参数,我们还原了活细胞内的真实CFP-Jun和YFP-Fos蛋白化学计量比例。通过还原的供受体蛋白浓度比例对经典FRET公式NFRET、FRETN、FR、FRETR、Eapp和EEFF作图,我们系统研究了供受体浓度比例对FRET定量计算公式的影响,并最终确定了这些公式的适用条件。FADD是凋亡信号中的一类接头蛋白,在死亡受体介导的细胞凋亡中发挥重要作用。在经典的配体受体依赖的细胞凋亡信号途径中,如果凋亡受体Fas被激活,FADD通过其C末端死亡结构域(death domain)与Fas的胞内区结合,而其N末端死亡效应结构域(deatheffector domain)可以作为招募平台来招募caspase8,从而使得caspase8自激活,并激活下游caspase3,从而介导细胞死亡配体依赖的细胞外凋亡信号。FADD除了作为接头蛋白介导外界凋亡诱导信号外,在细胞中过表达FADD蛋白还会诱导FADD的非经典细胞凋亡途径。即FADD蛋白的自身聚集,形成特殊的死亡效应纤维(DEF)结构,DEF上可以招募caspase8,从而引起非死亡配体受体依赖的细胞凋亡。虽然FADD蛋白自身聚集形成DEF的现象已被前人研究所报道,但究竟FADD在活细胞内如何形成DEF导致细胞凋亡,FADD蛋白分子的哪些结构区域决定了FADD蛋白自身的聚集,以及各区域是否能调控FADD自身相互作用的内在机制还不是很清楚。基于以上建立的活细胞FRET检测平台,我们对FADD蛋白在活细胞中的自身相互作用进行了定量测定和荧光成像。首先,我们通过定性荧光光谱实验发现FADD自身相互作用由其DED介导,活细胞数据验证了前期报道的DED结构中F25决定了其自身相互作用。其次我通过定量FRET成像实验首次发现了FADD的C末端“尾巴”具有调控FADD自身聚集强度的功能,去除FADD的C末端“尾巴”,FADD蛋白在活细胞内更容易形成聚集体,并诱导更多比例的细胞发生凋亡,所以我们认为FADD蛋白C末端的“尾巴”具有稳定FADD蛋白的功能。相对于分子间FRET (inter-molecular FRET)敏化方法测定的复杂性,分子内FRET (intra-molecular FRET)的测量则简单得多,所以分子内FRET的模型更多被人们用于设计和构建FRET分子探针。我们自主设计了一种基于钙调素(CaM)和其相互作用蛋白c-FLIPL的新的钙离子成像探针,并通过调整c-FLIPL的区段初步优化了探针的动态范围。我们的实验表明,利用c-FLIPL (197-260)构建的探针具有更好的动态范围。活细胞实验证实了该类探针用于钙离子成像上的可行性。虽然相比于现有的经典钙离子成像探针YC3.60在动态范围上还有差距,但我们初步验证了c-FLIPL作为构建钙离子探针的可行性,并提供了一种新的钙离子成像探针构建方式,后续的探针动态范围上的提升还有赖于CaM与c-FLIPL相互作用的更多结构学数据。此外,我们还成功设计并构建了锌离子活细胞FRET探针,其基本原理是利用MT2A蛋白的α domain作为锌离子感受区,并利用circularly permuted GFP技术优化出高动态范围的锌离子探针,体外和体内试验都表明我们设计出的锌离子探针具有高特异性和高灵敏度的特点。我们研制出的锌离子探针为研究活细胞中锌离子信号提供了初步基础。