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猪圆环病毒2型(Porcine circorus type 2,PCV2),属于圆环病毒科(circoviridae)圆环病毒属的成员,是目前发现的最小的动物病毒。PCV2在1974年首次引起科学家的关注,随后,PCV2被发现与猪的多种病症有关,主要为断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)。此外,PCV2与猪的其它病症如流产、生殖障碍和非典型的猪繁殖与呼吸障碍综合征有关。在世界范围的猪群中PCV2抗体出现的血清阳性率很高,给世界范围内的养猪业带来极大的威胁。基于以上背景,本研究建立了快速准确检测PCV2的方法,主要研究内容如下:1.间接酶联免疫吸附检测方法的建立利用pET-32a(+)原核表达系统表达重组的His-Cap(核衣壳)蛋白,采用镍层析柱纯化重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定,证实该重组蛋白大小符合设计要求且能被PCV2特异性抗体识别。以纯化后的重组蛋白作为抗原建立了检测猪血清中PCV2抗体的间接ELISA方法。在对抗原包被浓度、抗血清稀释度、封闭液、封闭时间、酶标二抗稀释度和温育时间等条件的优化后,确定了重组蛋白的最佳包被浓度为5μg/mL,抗血清的最佳稀释度为1:160倍稀释,封闭液为1%牛血清白蛋白,封闭时间为60min,酶标二抗的稀释度为1:1000倍,二抗反应条件为37℃条件下孵育60min,底物的反应时间为37℃反应10min。在对临床样品的检测中,与标准的PCV2 ELISA检测试剂盒相比较,检测结果符合率为91.7%,证明该间接ELISA方法在检测PCV2抗体具有很大的优越性。2.实时定量PCR检测方法的建立根据GenBank公布的PCV2核衣壳蛋白基因ORF2序列,设计一对特异性引物,构建含有ORF2基因序列的标准质粒pGEX-6P-1-ORF2。用该质粒作为模板,对实时定量PCR反应条件进行了优化,建立了可以检测病毒核酸的实时定量PCR方法。研究结果表明,该方法检测灵敏度可达3.5×103Copies/μL,标准质粒拷贝数与Ct值之间的线性关系方程式为:Ct=-3.638×lg(Copies/μL)+41.399,与引起猪病的其它常见病毒、实验室常见菌基因组和培养PCV2细胞的核酸提取物无交叉反应。该方法在避免普通PCR污染问题的同时,可以高效特异地检测PCV2,在临床监控和生产实践中具有很大的应用价值。3.环介导的等温扩增(LAMP)检测方法的建立:本研究选用PCV2核衣壳蛋白基因序列作为靶序列,通过PrimerExplorer4.0软件分析,依据GC含量,末端稳定性,二级结构等参数,设计并筛选出了一组引物。利用该引物建立了PCV2 LAMP检测方法,对LAMP实验中的重要参数进行了优化,包括镁离子浓度和内外引物浓度及比例。灵敏度实验中对病毒DNA在9.5×106～9.5×102Copies/μL核酸浓度范围内有很好的扩增,且特异性好,与其它病毒无交叉反应。该方法检测速度快,灵敏度高,特异性强,不需要昂贵的仪器设备,因而适合PCV2的现场检测和大规模监控。