肺癌是一种常见的恶性肿瘤,肺癌的发病率在世界范围内呈上升趋势。随着人类生活环境的污染与破坏,人们的不良生活方式等各种因素,肺癌的高发病率与高死亡率已经成为关注的热点问题。尽管近来在诊断和治疗取得了进展,肺癌的预后仍然很差,其5年生存率一直在9%-14%左右,复发和转移是影响肺癌患者治疗效果和导致患者死亡的最主要原因。肿瘤的转移是一个复杂的过程,目前的研究发现,肿瘤的转移是一个动态的过程,涉及到肿瘤细胞、机体、靶组织的相互影响和作用,涉及到一系列肿瘤侵袭转移相关基因的结构或/和功能的异常,最终导致肺癌转移。因此,探索研究新的基因功能与肺癌转移恶性特征的关系,对于提升肺癌进展相关分子机制的了解、设计合理的治疗药物及改善肺癌的临床预后非常关键。近年来,大量研究表明转录调节因子MTA家族蛋白对肿瘤转移有着重要影响。MTA基因家族,最初是在鼠转移性乳腺癌中经cDNA库差异筛选技术发现而命名。目前的研究热点集中在MTA1基因上面。近五年来,MTA1在各种肿瘤发生发展中的重要性被广泛认知。MTA1具有可以抑制或激活肿瘤基因的双重作用,在肿瘤生物学上扮演重要角色。在人类肿瘤中有广泛的过表达,并且与肿瘤的转移和侵袭有密切的联系,但具体的机制并不清楚。对子宫内膜癌、胰腺肿瘤、喉癌等肿瘤组织的分析发现MTA1mRNA或MTA1蛋白的过度表达均与肿瘤侵袭和/或淋巴结转移正相关,且在乳腺癌、肝癌、食道癌中,MTA1表达亦与预后呈负相关。我们的前期研究发现,MTA1是一种重要的肺癌相关基因,其过表达具有促进癌细胞分裂增殖和侵袭迁移等功能,可能是肺癌细胞特征性行为表现的关键环节或本质原因之一。microRNA是近年来发现的与基因表达调控相关的一类非编码小分子单链RNA,长度约21-22个碱基对构成,可作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤进程中的多个环节,但迄今对microRNA参与肿瘤转移的机制尚未完全明确。大量研究显示同种microRNA在不同类型肿瘤中可通过作用于不同编码基因,经不同的信号通路发挥不同的作用。因此需要对特定microRNA在特定环境下的靶基因进行更多、更详尽的研究,为肿瘤的诊断和治疗开发特异性药物。为此,本项目拟以体外培养的、来自同一细胞系(PLA-801)具有相同遗传背景的人肺癌高低转移株95D和95C为研究对象,采用生物信息学方法及MTA1基因转染或RNA干扰、microRNA过表达或抑制、靶基因表达检测、细胞功能分析等技术手段,结合肺癌临床组织样本分析,研究MTA1基因促进肺癌细胞侵袭转移的作用机理与其调节表达的microRNA之间的关系,旨在阐明MTA1促进肺癌细胞侵袭转移作用的分子靶点,阐明受MTA1调节表达的microRNA的功能。为进一步明确肺癌侵袭转移的分子机制,寻找潜在治疗靶点进行有益的探索。研究目标研究MTA1基因促进肺癌细胞侵袭转移的作用机理与其调节表达的microRNA之间的关系,旨在阐明MTA1促进肺癌细胞侵袭转移作用的分子靶点,同时也阐明受MTA1调节表达的microRNA的功能,进一步明确肺癌转移的分子机制,寻找可能的抗肺癌转移治疗靶点。方法1、慢病毒包装载体的构建设计三段MTA1siRNA及非特异性干扰片段,采用TCTCTTGAA茎环结构,在5’端和3’端分别加上MluI和ClaI酶切位点,3’端加上TTTTT终止序列,设计合成其shRNA的DNA Oligo寡核苷酸序列。设计合成的上游链和下游链退火形成寡核苷酸双链,将pLVTHM载体采用内切酶ClaI和MluI进行双酶切,获得粘性末端线性化片段,双酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳1.5h,胶回收方法获得线性化片段,用于后续连接反应。将目的片段回收纯化后,将回收的pLVTHM线性化片段与MTA1双链oligo进行连接反应,构建重组慢病毒干扰载体pLVTHM/shMTA1及pLVTHM/vectorc从-70℃拿出分装好的Sta13大肠杆菌感受态(每管200μ1),冰上溶解,加入10μpLVTHM-shMTA1连接产物进行转化,将连接产物进行转化后,37℃培养过夜,次日挑取单个菌落接种到5m1氨苄青霉素抗性的LB培养基中进行培养,对菌液进行PCR鉴定,PCR鉴定为阳性者送测序。2、稳定沉默MTA1肺癌细胞株的构建pLVTHM/shMTA1重组载体及非特异性、空白对照载体构建成功后,中量提取质粒,并进行慢病毒包装、测定病毒滴度。将含有MTA1-shRNA的慢病毒(pLVTHM/shMTA1)和非特异性干扰片段pLVTHM/vector的慢病毒及空载对照慢病毒(pLVTHM)分别感染高表达MTA1的95D,次日去除含病毒的培养基,更换为完全培养基,感染72h后荧光显微镜下观察GFP的发光情况。由于载体pLVTHM只带有绿色荧光标记(GFP)而不带抗性标记,因而病毒感染后稳定细胞株的建立不能采用常规的抗生素筛选单克隆的方法。鉴于慢病毒感染效率较高,本研究依据GFP标记,对多克隆细胞进行96孔板有限稀释,进行单克隆细胞的挑选。选取稳定发光的单克隆细胞进行总RNA的提取,逆转录成cDNA,通过荧光定量PCR鉴定干扰后单克隆细胞中MTA1的表达。提取细胞蛋白质后,通过Westernblot鉴定干扰单克隆细胞中MTA1在蛋白水平的表达。通过这两个试验,观察MTA1的沉默效率。3.CCK-8法检测MTA1沉默后对肺癌细胞生长特性的影响1×103个指数生长期细胞接种于96孔板中,每孔细胞悬液量为200u1,置于培养箱中分别培养1、2、3、4、5、6、7天,每孔加入10ul的CCK-8溶液,将培养板置于培养箱中孵育1h,用酶标仪测定在450nm处的OD值,以相对应OD值表示细胞增殖能力大小。每组设6个重复孔,取平均值,绘制体外生长曲线。4.划痕实验将95D/NC,95D/CTL-si,95D/MTA1-si1#3组细胞分别接种1×105个细胞于6孔板,每组细胞作3个重复孔,待细胞长至约90%汇合时,用200u1枪头垂直在培养孔中部轻轻划过,垂直和水平方向各交错划3条线,力度以划落细胞而不在培养板上留下痕迹为准。用PBS冲洗干净脱落的细胞,加入培养基后继续培养。每个孔随机选取9个有划痕穿过的视野,分别观察Oh,12h,24h时3组细胞划痕处细胞的运动变化,并拍照取样,应用Image J软件测划痕相对宽度,绘制迁移力量值曲线,独立实验重复3次。5.克隆形成试验取95D/NC,95D/CTL-si,95D/MTA1-si1#3组细胞对数期分别接种100个于六孔板中,每组细胞作3个重复孔,轻轻晃动培养板,使细胞分散均匀,37-C、5%C02培养箱中培养2周。出现肉眼可见的细胞克隆时,终止培养,PBS液洗3次后,置于室温中空气干燥；甲醇固定15min,弃甲醇后室温空气干燥；用苏木紫应用染液染色15min,流水缓慢洗去染液,室温空气干燥后显微镜下计数形成的克隆数(≥50个细胞为一个克隆)。实验重复3次。平板克隆形成率=形成克隆数/接种细胞数×100%6.流式细胞术检测细胞周期收取对数生长期的细胞,细胞密度约为1-10×105个/ml,按下述方法进行PI染色：收集细胞,用预冷的PBS离心(800rpm,5min),洗涤细胞两次,去除残留培养基；预冷的70%乙醇4℃固定过夜。用4°预冷的PBS离心(800rpm,5min)洗涤2次,加入400μlPBS重悬细胞,加入RNase A至终浓度0.5mg/ml,碘化丙啶(PI,10μg/ml)染色30分钟；避光冰上放置15分钟,上机检测；经FACSCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取全部数据；全部实验重复3次。用单因素方差分析对三种细胞中各期细胞的比例进行统计学分析。7. Transwell小室细胞迁移实验本实验所用Transwell小室购自美国Corning公司,小室孔径为8.0μm。取对数期的生长细胞,PBS洗1—2遍,胰酶消化后吹打均匀,终止消化后离心弃去培养液,PBS洗1—2遍,用含BSA的无血清培养基重悬,细胞计数,调整细胞密度至1—10×105,加2001μl细胞悬液于内室,然后加500μ1含10%胎牛血清的完全培养基于下室,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失,若出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板,37℃培养12h。取出小室,用棉签轻轻擦掉未穿过膜的细胞,甲醇固定15min,弃甲醇后室温空气干燥,用苏木紫染液染色15min,用去离了水轻轻地冲洗数次,室温空气中风干。显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过膜的细胞数。重复3次。8. Transwell小室体外侵袭实验本实验所用Transwell小室购自美国Corning公司,小室孔径为8.01μm。实验用的人工重构基底膜材料Matrigel,主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原。铺设基底胶前将枪头,Transwell小室,等放于4°冰箱预冷后,用50mg/LMatrigel1:10稀释液均匀铺设在Transwell小室底部膜的上室面,置于37°培养箱中孵育1-2h,使基质胶凝固成膜后,吸出小室中残余液体,每孔加入50μl含10g/LBSA的无血清培养液,37℃,30min。取对数期的生长细胞,胰酶消化后吹打均匀,制成单细胞悬液,用无血清培养基洗涤细胞2次,细胞计数,调整细胞浓度为(1-2)×105/ml。加200μl细胞悬液于内室,然后加500μl含10%胎牛血清的完全培养基于下室,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失,若出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板,37℃培养12h。取出小室,用棉签轻轻擦掉未穿过膜的细胞,甲醇固定15min,弃甲醇后室温空气干燥,用苏木紫染液染色15min,用去离子水轻轻地冲洗数次,室温空气中风干。显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过膜的细胞数。重复3次。统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,结果用平均数±标准差(X±S)表示。运用One-WAY ANOVA进行统计分析,组间的多重比较方差齐用LSD进行多重比较,方差不齐用Dunnett’s T3进行多重比较；细胞体外生长实验采用析因设计的方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.成功构建了重组慢病毒干扰载体pLVTHM/shMTA1,非特异片段干扰慢病毒载pLVTHM/vector,空白对照慢病毒载体(pLVTHM),并成功转入高表达MTA1的人肺癌95D细胞中,构建了干扰效率较高的稳定沉默MTA1的人肺癌细胞株、非特异性干扰及空白对照细胞株。2.沉默MTA1基因后,人肺癌细胞95D的体外增殖能力没有明显变化,而细胞的迁移及侵袭能力有明显的降低。稳定沉默MTA1的细胞株95D/MTA1-si1#的体外增殖能力与空白对照95/NC及非特异性干扰细胞株95D/CTL-si相比没有显著差异(F=3.064,P=0.057),且细胞组别与天数之间无交互效应(F=1.172,P=0.334),说明MTA1基因沉默后细胞增殖能力未有明显改变,三组细胞增殖速度随时间变化趋势相同。平板克隆形成实验显示MTA1基因沉默后细胞的克隆形成能力未有明显改变(F=3.085,p=0.095)。细胞周期试验显示,MTA1沉默后的肺癌细胞95D/MTA1-si1#与空白对照细胞株95/NC,及非特异性干扰细胞株95D/CTL-si相比,GO/G1(F=0.998,P=0.423)；G2/M期(F=0.998,P=0.315)期；S(F=3.778,P=0.087)期比例改变无统计学意义。在细胞划痕实验中,随着培养时间的延长,MTA1沉默后的肺癌细胞95D/MTA1-si1#迁移距离明显小于空白对照组及非特异性干扰组细胞(F=139.429,P<0.01),析因设计的方差分析结果显示,细胞组间与时间之间存在交互效应(F=20.703,P<0.01),说明随着时间的变化,两组细胞体外迁移距离的变化趋势不同,MTA1沉默后95D细胞的迁移能力有所减弱。Transwell小室检测细胞体外迁移能力的变化,结果显示,MTA1稳定沉默后的细胞株95D/MTA1-si1#的迁移能力明显弱于空白对照细胞株95/NC,及非特异性干扰细胞株95D/CTL-si (F=333.902, P<0.01)。Transwell小室分析细胞体外侵袭能力的变化,结果发现,与空白对照细胞株95/NC,及非特异性干扰细胞株95D/CTL-si相比,MTA1稳定沉默后的细胞株95D/MTA1-si1#穿过基质胶的细胞数显著减少,其体外侵袭能力显著降低(F=173.561,P<0.01)。综合以上结果表明,沉默MTA1基因抑制了肺癌细胞的体外迁移和侵袭能力,但对细胞的增殖能力没有明显影响,亦并未导致细胞周期的改变。进一步验证了MTA1在肺癌中的生物学功能。3.沉默MTA1基因后,用基因芯片检测到肺癌细胞40种microRNA的表达谱发生改变,其中6种microRNA的表达差异倍数>2,分别是分别是miR103、miR125b、 miR194、miR210、miR500、miR744。其中,MTA1基因沉默后,表细胞株中miR125b、miR194的表达量显著上升,miR210、miR500、miR103的表达量显著降低,miR-744的表达量没有明显改变。结论：1.MTA1基因干扰后,对肺癌细胞95D的体外增殖能力没有明显影响。2.MTA1基因干扰后,肺癌细胞95D的体外迁移和侵袭能力有显著降低。3.MTA1基因干扰后,肺癌细胞95D的体外迁移和侵袭能力有显著降低。4.在分别稳定转染了MTA1干扰载体,非特异性干扰载体和空载体的人肺癌细胞中用基因芯片检测了发现了40种microRNA的表达谱发生改变,其中6种microRNA的表达差异倍数>2,分别是分别是miR103、miR125b、miR194、 miR210、miR500、miR744.5.经过Real-time PCR验证,MTA1基因沉默后,细胞株中miR125b、miR194的表达量显著上升,miR210、miR500、miR103的表达量显著降低,miR-744的表达量没有明显改变。