第一部分腰果酸减轻胶原诱导关节炎的机制研究目的:腰果酸是一类15-碳烷基链含有不同饱和度的6烷基水杨酸的总称,具有抗癌、抗菌等生物活性。腰果酸作为组蛋白乙酰转移酶的抑制剂,显示诱导细胞凋亡的能力。类风湿关节炎(RA)是一种慢性炎症性疾病,缺乏有效治愈手段。本部分旨在通过胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠建立类风湿关节炎模型,研究腰果酸对CIA的保护作用。方法:雌性DBA/1J小鼠(6周龄)共32只,随机分为4组,每组8只。对照组,造模组,低腰果酸组和高腰果酸组。将100μg鸡II型胶原溶解于0.05M乙酸,然后与等体积完全弗氏佐剂充分乳化,并且加入4毫克/毫升热杀死分枝杆菌。初次免疫于小鼠尾根部2-3cm处皮下注射。21天后,采用100微克鸡II型胶原与不完全弗氏佐剂充分乳化进行了加强免疫。正常对照组注射等量的生理盐水。从加强免疫当天开始,腰果酸组小鼠通过腹腔注射腰果酸,剂量为1或5毫克/千克体重,每周两次,共注射3周。每周两次评估关节炎严重指数。0=没有征兆;1=手腕或脚踝轻度肿胀;2=从脚踝延伸到跗骨的适度肿胀;3=从脚踝向跖骨关节延伸的适度肿胀;4=手腕和脚踝严重肿胀。免疫后第42天,小鼠被处死,收集血清,对后肢进行解剖并进行组织学分析。小鼠踝关节置于10%中性福尔马林溶液中固定,脱钙,并脱水,石蜡包埋及切片。组织切片接受苏木精和伊红染色,由病理专家通过盲评的方式分析各组小鼠踝关节软骨的破坏情况。滑膜炎、翳形成、骨侵蚀、软骨破坏程度按以下标准评分:0、正常;1、轻度变化;2、适度的变化;3、强烈变化。应用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定血清细胞因子TNF-α和IL-1β的水平。结果:正常对照组中小鼠足踝部无红肿溃烂等现象,关节炎指数评分为0;模型组中小鼠出现不同程度急性关节炎足踝部红肿症状,关节炎评分在免疫后第6周达到13.86±1.25。使用腰果酸处理后,关节炎指数显著下降,尤其是高浓度腰果酸处理后关节炎指数降为3.41±1.18,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。免疫后第6周,模型组中小鼠血清TNF-α和IL-1β的水平显著高于对照组(P<0.05)。与模型组比较,腰果酸处理组血清TNF-α和IL-1β水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。并且,高剂量腰果酸处理对血清TNF-α和IL-1β水平的抑制更明显。结论:腰果酸可以减轻CIA模型小鼠炎症反应,这表明腰果酸具有抗炎的效应。其抗炎作用与抑制TNF-α和IL-1β的产生有关,因而腰果酸可能是一个有效的抗RA药物。第二部分腰果酸抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖和侵袭的机制研究目的:成纤维细胞样滑膜细胞(FLSs)过度增殖以及侵袭是导致RA软骨和骨骼破坏的一个重要因素。因此,FLSs已成为研究RA发病机制和治疗的独特靶细胞。微小RNA(micro RNAs)是一类小的非编码调控RNA,通过靶基因的裂解或蛋白质的转化抑制来抑制多种基因的表达。本部分拟重点研究腰果酸对RA FLSs的生物学行为的调控作用并深入探讨micro RNAs在其中的功能。方法:RA FLSs与不同浓度的腰果酸(5﹑30和60μM)孵育,同时添加TNF-α(10ng/m L)或IL-1β(10 ng/m L)。孵育48小时后,收集细胞用于后续实验。为了抑制Akt活性,在一些实验中加入MK-2206(1μM)及TNFα(10 ng/ml)或IL-1β(10 ng/ml),然后孵育48小时,并测量细胞增殖和侵袭情况。RA FLSs应用TNF-α(10 ng/ml)或IL-1β(10 ng/ml)处理48小时之后,细胞与20μM Ed U孵化2小时,细胞采用Hoechst 33342(5 mg/m L)复染。在显微镜下对阳性细胞进行了检查,每孔至少统计300个细胞。取细胞悬液加入Transwell上室。无血清培养液中含不同浓度的腰果酸及TNF-α(10 ng/ml)或IL-1β(10 ng/ml)。下室加入含有10%血清的培养基。孵化后48小时,检测细胞侵袭情况。应用蛋白免疫印迹和定量PCR法检测Akt蛋白表达情况。Akt 3′UTR片段经PCR扩增然后插入至p GL3荧光素酶报告载体。Akt表达质粒与mi R-633模拟物共同转染至RA FLSs。我们将Akt 3′UTR报告基因与mi R-633模拟物或对照mi RNA以及海肾荧光素酶表达质粒一起转染至HEK293T细胞。转染后48小时,裂解细胞,荧光素酶活性使用双荧光素酶检测系统测量。结果:TNF‐α和IL‐1β诱导的RA FLSs增殖明显受腰果酸的抑制。此外,腰果酸的抗增殖作用以浓度依赖性的方式存在。Transwell侵袭检测进一步表明,TNF‐α和IL‐1β诱导的细胞侵袭在腰果酸存在时被减弱。腰果酸处理显著抑制了Akt的蛋白表达和磷酸化。实时定量PCR分析表明,腰果酸处理对Akt的m RNA表达水平没有显著影响。与对照组相比,腰果酸处理的RA-FLSs中mi R-633的表达水平增加4.8倍以上(P<0.05)。mi R-633的过度表达显著降低了荧光素酶Akt3′UTR的活性。与此一致,mi R-633过度表达显著抑制Akt在RA-FLSs的蛋白表达,而不改变Akt m RNA的水平。与腰果酸引起的效应类似,mi R-633的过度表达明显抑制了RA FLSs的增殖和侵袭。进一步实验表明,过度表达Akt恢复了mi R-633高表达RA FLSs的增殖和侵袭能力。应用化学抑制剂阻断Akt的活性也导致RA FLSs的增殖和侵袭能力的下降,即使暴露于TNF‐α和IL‐1β的条件。沉默mi R-633增强了RA FLSs对腰果酸诱导的抑制增殖和侵袭活性的抵抗力。此外,下调mi R-633逆转腰果酸对Akt表达的抑制作用。结论:我们证实了腰果酸具有潜在的抗关节炎活性。腰果酸介导的抑制RA FLSs的增殖和侵袭与诱导mi R-633和下调Akt表达有关。这些结果表明,腰果酸可能为治疗RA提供新的思路。