肿瘤可以借助各种机制逃避宿主的免疫监视与清除,免疫逃逸或免疫反击是肿瘤发生发展过程中的一个重要的特征。但过去数十年来,对肿瘤免疫逃逸的研究主要集中在宿主特异性细胞免疫缺陷及其机制。近年发现,肿瘤微环境中的炎性反应也在肿瘤发生发展的各个环节起不可忽视的作用。炎性反应可促进肿瘤细胞增殖并对抗凋亡,促进肿瘤新生血管形成及肿瘤转移,逆转抗肿瘤免疫反应,还可改变肿瘤对激素及化疗药物的反应等。因此,炎性反应已被认为是肿瘤的另一个特征性标志。巨噬细胞(macrophage)是机体重要的炎性细胞,在肿瘤炎性反应中,它通过分泌氮自由基和血管生成因子等多种化合物促进肿瘤的发生,刺激肿瘤的生长、转移及血管生成,与肿瘤患者的预后相关。巨噬细胞与树突状细胞(dendritic cell,DC)有共同的前体细胞-单核细胞。DC是目前发现的效能最高的专职性抗原提呈细胞,是唯一能够刺激初始T细胞并使其增殖的抗原提呈细胞,因此被认为是机体免疫反应的始动者。已有研究发现,肺癌细胞可以通过分泌相关因子诱导外周单核细胞使其向巨噬细胞分化,并抑制其向DC分化。然而一般认为,当DC成熟后这种诱导作用便不复存在,迄今尚未见关于成熟DC向巨噬细胞转化的研究报导。如果这一转化途径存在,则提示肿瘤细胞具有同时抑制细胞特异性免疫和促进非特异性炎性反应的能力。卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。大量研究发现,卵巢癌患者存在腹腔和全身的双重免疫缺陷,在肿瘤免疫研究中,卵巢癌是一个非常理想的生物模型。已有报道,卵巢癌腹水中的巨噬细胞表达抑制分子B7-H4,并与调节性T细胞的数量相关,另有报道在卵巢癌腹水及不同癌细胞培养的上清作用下,单核细胞可以向肿瘤相关性巨噬细胞分化。我们先前的研究证实,卵巢癌细胞培养上清可体外抑制Lin~-CD45RA~-DC前体细胞向成熟DC亚群的分化,结果引起髓样DC减少和浆液样DC增多。本研究首先建立从人外周血单核细胞经体外联合培养诱导出成熟DC的技术平台,其次利用卵巢患者腹水及卵巢癌细胞培养上清模拟卵巢癌微环境,证实卵巢癌细胞可以诱导成熟DC向巨噬细胞转化这一途径,并进一步探讨卵巢癌细胞诱导这一转化途径的可能机制。第一部分人外周血DC的体外扩增与成熟目的:从健康人外周血中分离和纯化单核细胞,在体外经联合培养分化为成熟DC,为后续实验奠定基础。方法:免疫磁珠法分离外周血CD14~+单核细胞,经GM-CSF、IL-4联合培养6天生成未成熟DC,再加入LPS刺激24小时促进DC成熟,培养过程中相差显微镜观察细胞形态,并经流式细胞仪检测细胞表面标志物CD14/CD1a和CD83。结果:1、细胞形态:联合培养7天后镜下见到典型的DC形态。2、体外培养DC的表型变化:新鲜分离的单核细胞细胞标记为CD14~+CD1a~-,CD83表达很低,而经联合培养7天后,CD14~+CD1a~-单核细胞大部分分化为CD14~-CD1a~±DC细胞,CD83表达升高显著。结论:联合应用GM-CSF、IL-4和LPS等细胞因子能成功诱导外周血CD14~+单核细胞分化为成熟DC。第二部分卵巢癌细胞诱导成熟DC向巨噬细胞转化目的:证实卵巢癌细胞能够体外诱导外周成熟DC向巨噬细胞转化。方法:收集按照第一部分方法获得的成熟DC,分为两个培养体系,1、腹水(腹腔液)体系,分为两组:(1)对照组:加入50%非癌性腹腔液;(2)实验组:加入50%的卵巢癌腹水。2、上清培养体系,分为三组:(1)对照组:加入50%对照上清;(2)SKOV3上清组:加入50%SKOV3培养上清;(3)CAOV3上清组:加入50%CAOV3培养上清。两个体系培养48小时后流式细胞仪检测细胞表面标志物CD14/CD1a和CD83的表达及细胞吞噬dextran的吞噬能力,MLR检测细胞体外刺激同种异体T细胞能力。结果:1、与非癌性腹腔液组相比,腹水组中CD14~+CD1a~-细胞显著增多,且CD83下降显著,吞噬dextran的能力显著增强,刺激T细胞的能力减弱。2、与对照组相比,卵巢癌细胞SKOV3和CAOV3培养上清组中CD14~+CD1a~-细胞显著增多,且CD83下降显著,吞噬dextran的能力显著增强,刺激T细胞的能力减弱。结论:卵巢癌腹水和细胞培养上清能够诱导部分成熟DC向巨噬细胞转化。第三部分卵巢癌细胞分泌的IL-10介导成熟DC向巨噬细胞转化目的:证实细胞因子IL-10和LIF在卵巢癌细胞诱导成熟DC向巨噬细胞转化过程中的作用。方法:收集成熟DC(方法同第一部分),分为如下三个培养体系,共同培养48小时后流式细胞仪检测细胞表面标志物CD14/CD1a、CD83的表达及细胞吞噬dextran的吞噬能力,MLR检测细胞体外刺激同种异体T细胞能力。1、细胞因子培养体系:分为3组,(1)空白对照组;(2)IL-10组:加入重组IL-10(100ng/ml);(3)LIF组:加入重组LIF(100ng/ml)。2、腹水(腹腔液)培养体系:分为4组,(1)非癌性腹腔液组:加入50%非癌性腹腔液;(2)卵巢癌腹水组:加入50%卵巢癌腹水;(3)卵巢癌腹水+IL-10抗体组:加入50%卵巢癌腹水+IL-10中和性抗体(2ug/ml);(4)卵巢腹水+LIF抗体组:加入50%卵巢癌腹水+LIF中和性抗体(2ug/ml)。3、上清培养体系:分为7组,(1)对照组:加入50%对照上清;(2)SKOV3上清组:加入50%SKOV3培养上清;(3)SKOV3上清+IL-10抗体组:加入50%SKOV3培养上清+IL-10中和性抗体(2ug/ml);(4)SKOV3上清+LIF抗体组:加入50%SKOV3培养上清+LIF中和性抗体(2ug/ml);(5)CAOV3上清组:加入50%CAOV3培养上清;(6)CAOV3上清+IL-10抗体组:加入50%CAOV3培养上清+IL-10中和性抗体(2ug/ml);(7)CAOV3上清+LIF抗体:加入50%CAOV3培养上清+LIF中和性抗体(2ug/ml)。结果:1、细胞因子培养体系中,与对照组相比,IL-10组CD14~+CD1a~-细胞显著增多,且CD83表达显著下降,吞噬dextran的能力上升,刺激T细胞的能力下降,而LIF组细胞的上述指标无显著变化;2、在腹水培养体系中,IL-10中和抗体可以部分阻断卵巢癌腹水诱导成熟DC转化为巨噬细胞,而LIF中和抗体不阻断转化过程;3、在上清培养体系中,IL-10中和抗体也可以部分阻断卵巢癌细胞SKOV3和CAOV3诱导成熟DC转化为巨噬细胞,而LIF不阻断转化过程。结论:IL-10介导了卵巢癌腹水和卵巢细胞培养上清诱导成熟DC向巨噬细胞的转化,而LIF不参与这一过程。