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甲哌霉素A-F（marformycins A-F）是由南海深海来源放线菌Streptomycesdrozdowiczii SCSIO10141所产生的一类新颖的环酯肽类化合物，对藤黄微球菌和厌氧痤疮丙酸杆菌具有较好的抑制活性，具有潜在的药用价值。本课题组前期已经鉴定了marformycins的生物合成基因簇，基因簇长约45kb，含有20个开放阅读框。marformycins的生物合成基因簇中除了包含6个非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetases，NRPs）骨架基因，其中还包括一些前体合成修饰基因、后修饰基因、调控基因及抗性基因。本研究以marformycin生物合成基因簇中甲基转移酶基因mfnG，鸟氨酸羟化酶基因mfnI及转运蛋白基因mfnR为研究对象，进行了体内基因阻断和体外生化验证的工作，取得以下成果: 1.为了探究marformycin结构中OMe-D-Tyr结构单元的生物合成机制，本研究构建了甲基转移酶基因mfnG的蛋白表达菌株E.coli BL21/pET28a-mfnG，表达并纯化蛋白MfnG。体外生化反应证明甲基转移酶MfnG可以以L-Tyr或D-Tyr为底物，SAM作为甲基供体在50 mM pH8.0的PBS缓冲体系中30℃水浴条件下完成酪氨酸的甲基化反应。随后通过动力学实验分析了酶的底物特异性及亲和能力，实验证明MfnG对L-Tyr亲和能力更好，这一结果阐明了marformycin生物合成过程中的酪氨酸前体甲基化过程。 2.为了探究marformycin及其相关的himastatin结构中哌嗪酸结构单元的生物合成机制，本研究利用生物信息学分析了乌氨酸羟化酶MfnI及HmtM，认为其属于N-hydroxylating flavoprotein monooxygenases(NMO)家族。表达并纯化蛋白MfnI与HmtM，体外生化反应证明鸟氨酸羟化酶MfnI，HmtM均可以利用L-Orn，在辅助因子NADPH和FAD的存在下完成羟基化反应，体外反应最适条件为pH7.4的PBS缓冲体系，28℃气浴摇动反应。这一结果证明了marformycin及himastatin生物合成基因簇中鸟氨酸羟化酶基因mfnI及hmtM的功能，为阐明哌嗪酸生物合成机制奠定基础。 3.为了研究marformycin生物合成基因簇中ABC转运蛋白编码基因mfnR的功能，本研究通过PCR-targeting方法获得了ABC转运蛋白编码基因mfnR的体内阻断突变株，突变株发酵结果显示其失去生产marformycin的能力，从而证明ABC转运蛋白MfnR在marformycin生物合成过程中执行其相应的转运功能，将产生的marformycins及时运送到胞外。 本论文在前人的研究基础上对marformycin生物合成途径中三种重要酶的功能进行了分析与鉴定，进一步阐释了marformycin生物合成机制，同时为构建高产菌株用于工业生产目标化合物提供了理论基础。