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目的在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发病机制中,线粒体形态结构改变及线粒体DNA突变可造成线粒体功能紊乱,表现为电子传递链受损、自噬增加、生物能量损伤、分裂融合障碍等,最终导致不可逆的神经元损伤。在AD动物及患者体内存在硫化氢(Hydrogen sulfide,H2S)稳态失衡现象。最近发现H2S的线粒体作用包括抗氧化,抗凋亡及调节维持细胞生物能量代谢。AP39是一种新合成的线粒体靶向的H2S供体,其保护作用在其他体内外模型中得以验证。然而,AP39对AD线粒体功能障碍可能的保护作用及其机制尚不清楚。本研究为了明确AP39对APP/PS1双转基因小鼠和神经元线粒体功能障碍的作用及其机制。方法首先把APP/PS1转基因小鼠按照不同月龄分为3组(3、6、12month),水迷宫实验(Morris water maze test)和新物体识别实验(novel object recognition task,NORT)观察小鼠认知功能的变化;亚甲基蓝分光光度法检测小鼠皮质和海马中H2S水平和体内生成H2S的三1个酶的活性变化:胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionine-γ-lyase,CSE)、胱硫醚-β-合成酶(Cystathionine-β-synthase,CBS)、3-巯基丙酮酸转硫酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3MST);Western blot实验分析CSE、CBS、3MST三者蛋白的表达情况。APP/PS1孕鼠在妊娠期15-16(E15-16)天被处死,胎鼠脑被用来取材培养原代皮层神经元。用细胞免疫荧光化学方法鉴定神经元。神经元被不同浓度AP39处理后,MTT法检测神经元活力,LDH法检测神经元损伤,TUNEL法检测神经元凋亡,亚甲基蓝分光光度法检测神经元中H2S水平,荧光探针检测线粒体中H2S的生成,XF24 Extracellular Flux Analyzer(细胞代谢呼吸动态分析仪)检测神经元线粒体的呼吸功能。用Si RNA干扰SQR后对APP/PS1神经元线粒体有氧呼吸的影响。不同浓度AP39处理后,线粒体呼吸酶复合物I-IV酶活性试剂盒检测其各自的活性。ATP试剂盒检测神经元内ATP的含量。PCR方法检测核DNA和线粒体DNA(mt DNA)的完整性。活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)试剂盒评估细胞内ROS的生成。线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential assay)试剂盒检测神经元线粒体膜电位的变化。Western blot实验分析线粒体融合分裂蛋白:融合蛋白1(Mitofusin1,Mfn-1),融合蛋白2(Mitofusin2,Mfn-2),视神经萎缩症蛋白(Optic atrophy-1,OPA-1),Fis-1及动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)的表达情况。其次再将12月龄APP/PS1双转基因小鼠和野生型(Wild-type,WT)小鼠分为四组,各组25只,分别是:WT小鼠H2O处理对照组(WT+H2O);WT小鼠AP39处理组(WT+AP39);APP/PSl转基因小鼠H2O处理组(APP/PS1+H2O);APP/PSl转基因小鼠AP39处理组(APP/PS1+AP39)。AP39或H2O每天一次通过腹腔注射治疗小鼠6周,然后进行Morris实验和NORT测试。行为学测试后,各组小鼠行头颅MRI扫描,然后被处死收集血液和脑组织。将血液收集到肝素化管,4℃1000g离心10min,收集的上清液通过ELISA试剂盒检测Aβ40和Aβ42水平。取得的脑组织通过透射电镜检测小鼠脑组织的线粒体形态结构,免疫组织化学方法检查脑组织Aβ沉积情况。结果1.3、6、12月龄转基因小鼠Morris和NORT实验结果显示:随着月龄增长,APP/PS1转基因小鼠寻找平台的潜伏期越来越长,穿梭目标象限的次数及滞留时间越来越少,对新物体B的认知指数越来越低(p<0.01)。2.随着月龄增长,APP/PS1转基因小鼠大脑皮质和海马中H2S水平逐渐降低,其中12月龄APP/PS1转基因小鼠皮质和海马中H2S水平降低最明显(p<0.05)。3.通过亚甲基蓝分光光度计法检测APP/PS1转基因小鼠组织内CSE、CBS、3MST酶活性,发现CSE酶活性在肝脏中表达最强,在大脑皮质和海马组织中几乎不表达。随月龄不断增长,大脑皮质和海马组织中CBS和3MST酶活性呈降低趋势,但3MST酶活性比CBS酶活性降低更为明显(p<0.01)。用Western blot方法检测CSE、CBS及3MST的蛋白水平,结果与酶活性变化相似。Western blot和细胞荧光免疫方法观察到3MST主要定位于神经元线粒体中。4.AP39可增加H2S的生成及调节WT神经元线粒体能量代谢:WT神经元经不同浓度AP39处理2h后,亚甲基兰法检测H2S的生成水平。25-250n M AP39可浓度依赖性地增加H2S的生成。在WT神经元,100n M AP39可引起线粒体基础呼吸速率显著增加,而250n M AP39导致基础呼吸速率明显减少(p<0.01)。25,100n M AP39可引起FCCP诱导的线粒体最大呼吸速率剂量依赖性增加,但250n M AP39明显降低了FCCP诱导的最大呼吸速率(p<0.01)。5.AP39可增加APP/PS1神经元细胞活力及降低LDH释放量:不同浓度AP39处理WT神经元24h对细胞存活率和LDH释放没有明显影响,但25,100n M AP39处理APP/PS1神经元24h可明显增加细胞活力及降低LDH释放量。TUNEL检测凋亡结果显示:APP/PS1神经元中凋亡阳性神经元数目比WT神经元中的凋亡阳性神经元明显增加(P<0.05),而25,100n M AP39处理神经元24h后,凋亡阳性神经元数目显著减少,但250n M AP39则会进一步增加神经元凋亡。6.AP39可调节APP/PS1神经元线粒体呼吸功能且SQR参与其调节过程:用XF24 Extracellular Flux Analyzer测量线粒体生物能量结果显示:APP/PS1神经元线粒体生物能量学参数显著降低(P<0.05)。100n M AP39可显著增加APP/PS1神经元的线粒体基础呼吸速率和最大呼吸速率(P<0.01)。干扰SQR后,APP/PS1神经元的基础呼吸速率和最大呼吸速率降低(P<0.01).7.AP39可保护线粒体功能:APP/PS1神经元线粒体呼吸链复合物I-IV活性均降低,而100n M AP39可明显增加APP/PS1神经元线粒体呼吸链复合物I-IV活性(P<0.01)。AP39显著增加了WT神经元和APP/PS1神经元的ATP产物。AP39可部分恢复APP/PS1神经元mt DNA的完整性。100n M AP39可有效降低APP/PS1神经元的ROS水平及恢复APP/PS1神经元的线粒体膜电位损伤。8.AP39可调节APP/PS1神经元线粒体动态平衡:通过Western blot实验分析参与线粒体动态平衡的蛋白水平。APP/PS1神经元的线粒体融合蛋白Mfn1和OPA1水平显著降低(P<0.01),线粒体裂变蛋白Fis1水平显着增加(P<0.05),Mfn2和Drp1蛋白水平无明显差异。100n M AP39可明显增强OPA1和Mfn1的蛋白表达,而显著降低Fis1的蛋白水平(P<0.01)。9.25-250n M AP39可剂量依赖性地增加WT和APP/PS1小鼠皮层和海马中H2S的生成。10.AP39可部分逆转APP/PS1转基因小鼠的记忆障碍:用100n M/Kg AP39分别处理12月龄AD小鼠和WT小鼠6周,Morris和NORT实验结果如下:WT小鼠随着训练天数的增加,探索平台潜伏期缩短,学习与记忆能力不断增强;相比WT野生型小鼠,APP/PS1转基因小鼠探索平台潜伏期较长,穿越平台所在象限(目标象限)的次数和滞留时间较少(P<0.01),AD模型小鼠行为表现较差,探索新物体B的时间百分比显著减少(P<0.01);而100n M/kg AP39治疗6周后降低了APP/PS1转基因小鼠探索隐藏平台的潜伏期,学习能力也不断增强,对目标象限表现出强烈的偏好,对新物体B认知指数显著增高(P<0.05)。25n M/kg AP39不能改善APP/PS1转基因小鼠的学习障碍。11.AP39可部分抑制APP/PS1转基因小鼠的脑萎缩:小鼠头颅MRI结果显示:WT小鼠没有明显大脑结构异常,两侧大脑半球侧脑室大小对称,边缘清晰。用H2O处理的12月龄APP/PS1小鼠大脑萎缩明显且侧脑室极为不对称,侧脑室左侧较右侧偏大且边缘不清楚,顶叶皮层和海马区的ADC值出现显著下降;而AP39可缓解AD模型小鼠的脑萎缩和侧脑室不对称,显著增加APP/PS1转基因小鼠顶叶皮层和海马的ADC值(P<0.01)。12.AP39对APP/PS1小鼠脑组织线粒体形态的影响:透射电镜结果如下:WT小鼠脑组织神经元线粒体形态基本正常,而APP/PS1小鼠脑组织神经元可观察到线粒体出现严重结构损伤,明显肿胀破裂,轮廓模糊,染色质深,出现分散的内质网和溶酶体小体,且细胞质中有明显的空泡形成。经AP39处理的APP/PS1小鼠脑组织神经元细胞的超微结构类似于WT小鼠神经元:线粒体双层膜结构完整,线粒体嵴排列整齐,结构正常。13.AP39可降低APP/PS1转基因小鼠Aβ水平及抑制Aβ沉积:各组小鼠脑组织ELISA结果显示:12月龄的APP/PS1转基因小鼠体内Aβ40和Aβ42的水平分别为:925.59和532.15 pg/ml;AP39处理后Aβ40和Aβ42水平显著降低,结果分别为:531.34和365.28 pg/ml。免疫组化结果如下:在WT小鼠尚未观察到淀粉样蛋白斑块(amyloid-β,Aβ)沉积;而相比WT小鼠,APP/PS1转基因小鼠脑组织细胞内的Aβ沉积数量和所占面积显著增加;AP39治疗显著抑制了AD小鼠皮层和海马组织中的Aβ斑块数量和大小(P<0.01)。结论随着年龄增长,APP/PS1转基因小鼠认知功能越来越差;大脑皮质和海马中H2S水平逐渐降低,CBS和3MST酶活性和蛋白水平逐渐降低,且3MST酶活性及蛋白水平比CBS降低程度更为明显;3MST主要位于神经元线粒体中。这些结果表明神经元线粒体的H2S主要是由3MST负责产生。AP39可增加神经元内H2S的生成,尤其是线粒体中H2S的生成。AP39对WT神经元中线粒体能量代谢呈现出双相调节作用。适当浓度的AP39对APP/PS1神经元有细胞保护作用,可抑制凋亡,保护线粒体功能和能量代谢,且SQR参与其线粒体能量代谢调节过程。100n M AP39可逆转APP/PS1转基因小鼠的记忆障碍,抑制脑萎缩,帮助恢复线粒体形态结构,降低体内Aβ水平和抑制Aβ沉积。这些结果表明AP39可能是一种潜在的AD治疗药物,其机制可能涉及保护线粒体损伤。