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心肌肥厚是心脏对多种病理性刺激的一种适应性反应,各种病理性刺激引起的压力负荷(如高血压、主动脉狭窄等)通过一系列复杂的细胞信号通路转导,在早期引起心肌细胞代偿性的肥大,表现为心室壁的增厚和心室收缩功能的增强,而这种刺激的持续存在将会引起RAAS系统和其他神经内分泌系统的过度激活,包括血管紧张素Ⅱ以及儿茶酚胺类激素的释放,造成心肌细胞氧耗量的增加,一旦心脏动脉血供不能满足肥大心肌的要求时,即进入不可逆的慢性心力衰竭期。因此,对于早期心肌肥厚的抑制可以延缓其进入心力衰竭期,降低心衰的死亡率。临床上血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)以及血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)等药物正是通过抑制RAAS系统的过度激活,减弱AT]受体的活化,从而起到心肌保护作用。ErbB受体为典型的酪氨酸激酶受体家族,有研究指出其与心血管的发育和心功能的维持相关。C/EBPβ蛋白为bHLH基因家族中的DNA结合转录因子,在细胞增殖中起着重要作用,近期有报道发现在某些生理或者病理状态下这些受体的激活能够抑制C/EBPβ蛋白,引起CITED4转录因子的升高从而促进心肌细胞的增殖,这已经在生理性心肌肥厚的小鼠模型中得以证实。因此,对于高血压或其他病理性刺激引起的心肌肥厚,如何通过调控C/EBPβ/CITED4的表达来促进心肌细胞的增殖无疑为病理性心肌肥厚的治疗提供了一条新的思路。近年来芪苈强心胶囊作为一种传统的中药复方制剂,已经广泛的在临床慢性心衰病人中使用,并且被报道能够增加心肌收缩力和增加肾脏血流量,并能够抑制炎症反应,从而改善心肌梗死所致心力衰竭。但是,在慢性高血压的状态下,芪苈强心胶囊是否能够改善心肌重构和由此引起的心功能不全目前还没有相关的研究报道,因此我们的研究首先证实了芪苈强心胶囊对慢性压力超负荷的小鼠具有心脏保护作用(升主动脉缩窄模型),通过与经典的ARB类药物氯沙坦相比较对相关的分子机制进行了初步的探讨。本研究首先通过缩窄升主动脉(TAC)构建C57B/L6小鼠压力超负荷心肌肥厚模型,心肌肥厚和心脏功能的指标通过小动物心脏超声、血流动力学和病理学检查,心肌肥厚标志基因使用实时定量荧光PCR方法检测,AT1受体和磷酸化ERK (p-ERK)、心肌凋亡的相关指标以及促进心肌细胞增殖的ErbB受体通过蛋白免疫印迹以及组织免疫荧光的方法检测。结果发现TAC术后2周引起的心肌肥厚可以明显被芪苈强心胶囊和氯沙坦所抑制,伴随有AT1,p-ERK蛋白表达的减少以及肥厚相关基因的下调。TAC4周后,虽然部分小鼠心肌肥厚进展为心功能不全甚至心衰,AT1表达上调仍然能明显被这两种药物所抑制。所不同的是,两种药物处理后ErbB受体表达却不一样,芪苈强心胶囊处理组,心肌组织磷酸化ErbB2和ErbB4的水平明显升高,而氯沙坦处理组未改变两者的磷酸化水平。为了更进一步的研究芪苈强心胶囊是否促进心肌细胞增殖,我们通过免疫荧光和免疫蛋白印迹分别检测心肌细胞的Ki-67阳性率及其调控蛋白C/EBPβ和CITED4转录因子的表达。通常Ki67是由C/EBPP蛋白表达下调和CITED4转录因子表达的升高(C/EBPβ/CITED4)来调控的。可以观察到TAC4W后,芪苈强心胶囊处理组心肌细胞的Ki-67阳性率明显增高,C/EBPβ蛋白表达下调和CITED4转录因子表达升高。抑制ErbB2或者是CITED4转录因子的表达部分消除了TAC术后4W芪苈强心胶囊处理组抑制心肌肥厚和对心功能的保护作用。因此,我们由此推断芪苈强心胶囊改善压力超负荷模型小鼠心功能的机制主要是通过抑制AT1受体上调减弱心肌肥厚信号的传导及激活ErbB受体调控C/EBP(3/CITED4促进心肌细胞的增殖。为了更深入研究芪苈强心胶囊是直接抑制ATl活性还是通过抑制AngII的产生改善压力超负荷介导的心肌肥厚,我们用血管紧张素原敲除(ATG-/-)小鼠及野生型小鼠通过缩窄升主动脉(TAC)构建压力超负荷心肌肥厚模型,2周后通过超声以及血流动力学检查肥厚指标,检测血管紧张素Ⅱ和ATl受体以及p-ERK水平的表达。结果发现在AngII缺失消除了芪苈强心胶囊对压力超负荷介导心肌肥厚的抑制。因此,我们发现芪苈强心胶囊与氯沙坦不同的是,其通过抑制AngII表达来减弱AT1受体激活,而非如氯沙坦一样能够直接抑制压力超负荷机械刺激引起AT1受体的激活。综上所述,芪苈强心胶囊对改善压力超负荷引起的小鼠心肌肥厚的可能机制是：首先通过抑制血管紧张素Ⅱ表达来减弱AT1受体激活,从而减弱病理性心肌肥厚下游信号的传导,同时在TAC术后4周,能够通过激活心肌细胞的ErbB受体以及通过调控C/EBPβ/CITED4表达变化,在一定程度上促进心肌细胞增殖来改善压力负荷导致的心室重构和心功能不全。第一部分AT1受体与ErbB受体参与芪苈强心胶囊改善压力超负荷致小鼠心肌肥厚和心功能不全的保护作用目的：探讨芪苈强心胶囊改善压力超负荷致小鼠心肌肥厚是否与AT1受体以及ErbB受体介导的心肌肥厚信号通路相关。方法：8-10周龄野生型C57B/L6雄性小鼠(WT)随机分为假手术组、生理盐水组、芪苈强心胶囊和氯沙坦四组,后三组小鼠行升主动脉缩窄手术(TAC)建立心肌肥厚模型,TAC组小鼠分别给予0.6mg/(kg.d)和13.4mg/(kg.d)药物灌胃处理,术后2周和4周分别行心超及血流动力学检查,同时行心肌组织病理学指标以及肥厚相关基因表达检测,蛋白印迹法(WB)检测血管紧张素Ⅱ-1型(AT1)受体及磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、磷酸化ErbB2(p-ErbB2)和磷酸化ErbB4(p-ErbB4)表达。结果：小鼠TAC后2周和4周,主动脉血压及左室收缩末期压显著升高,芪苈强心胶囊以及氯沙坦药物均对其均无影响。2周后,这两种药物均显著抑制TAC介导的左室前后壁增厚以及心肌细胞横截面积(CSA)和纤维化面积的增大,同时两种药物抑制肥厚相关基因、AT1受体和p-ERK表达上调(P<0.05),两组药物间未见明显差别(P>0.05)；4周后,生理盐水组小鼠出现心衰以及死亡率明显升高(P<0.05),而两种药物肥厚相关基因、AT1受体表达仍然被抑制,p-ErbB2与p-ErbB4的表达在芪苈强心胶囊组显著升高(P<0.05)。结论：芪苈强心胶囊与氯沙坦均能通过降低AT1受体激活程度改善压力超负荷致小鼠心肌肥厚,而与氯沙坦不同的是,芪苈强心胶囊能够激活ErbB受体,说明AT1受体与ErbB家族受体均参与了芪苈强心胶囊对压力超负荷致小鼠心肌肥厚的保护。第二部分芪苈强心胶囊通过调控C/EBPβ/CITED4表达促进心肌细胞增殖改善压力超负荷致小鼠心肌肥厚目的：探讨芪苈强心胶囊是否可以通过调控C/EBPβ/CITED4表达促进心肌细胞增殖改善压力超负荷致小鼠心肌肥厚。方法：用第一部分预留的小鼠心肌组织分别检测TAC术后小鼠心脏C/EBPβ蛋白以及CITED4蛋白表达水平,并且用实时荧光定量法检测C/EBPβ以及CITED4转录因子的mRNA表达水平,同时用免疫荧光法检测Ki-67阳性心肌细胞。构建CITED4siRNA质粒以及挑选出对靶基因抑制效果最好的siRNA。8-10周龄野生型C57B/L6雄性小鼠(WT)随机分为假手术组,生理盐水组,芪苈强心胶囊和芪苈强心胶囊+ErbB受体抑制剂,芪苈强心胶囊+CITED4siRNA五组,所有小鼠行假手术或TAC手术建立心肌肥厚模型,TAC组小鼠分别给予芪苈强心胶囊0.6mg/kg.d药物灌胃治疗,ErbB受体抑制剂(CI-1033)2mg/kg/d予以皮下注射,CITED4siRNA于TAC手术时心室腔内注射。术后4周分别行心超及血流动力学检查,同时行心肌组织病理学指标检测各组小鼠心肌肥厚程度。结果：小鼠TAC后4周,芪苈强心胶囊在蛋白以及mRNA水平均引起C/EBPβ表达下降以CITED4的表达上调(P<0.05),免疫荧光结果提示芪苈强心胶囊治疗后4周Ki-67阳性心肌细胞显著增多(P<0.05)。TAC4周之后,ErbB受体抑制剂以及CITED4siRNA干预组与芪苈强心胶囊治疗组相比,小鼠的左室收缩期末压显著升高,心脏收缩功能显著下降、CSA以及纤维化面积显著增大(P<0.05)。结论：芪苈强心胶囊能够通过调控C/EBPP/CITED4表达促进心肌细胞增殖改善压力超负荷致小鼠心肌肥厚,ErbB受体的阻断以及CITED4表达的下调使其保护作用消失。第三部分芪苈强心胶囊通过抑制血管紧张素Ⅱ减弱AT1受体的激活改善压力超负荷致小鼠心肌肥厚目的：探讨芪苈强心胶囊是否通过抑制血管紧张素II (AngII)表达减弱AT1受体的激活改善压力超负荷下小鼠心肌肥厚。方法：小鼠行升主动脉缩窄手术(TAC)建立心肌肥厚模型,8-10周龄野生型雄性小鼠(WT)和雄性血管紧张素原基因敲除小鼠(ATG-/-)随机分为假手术组、生理盐水组、芪苈强心胶囊三组,TAC组小鼠给予生理盐水或0.6mg/(kg.d)药物灌胃处理。术后2周行心超及血流动力学检查,同时分析心肌组织学指标以及肥厚相关基因表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆和心肌组织血管紧张素Ⅱ浓度,,蛋白印迹法检测磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)及血管紧张素Ⅱ-1型(AT1)受体表达。结果：WT和ATG-/-小鼠TAC后2周,主动脉血压及左室收缩末期压显著升高,芪苈强心胶囊对其均无影响。WT小鼠中,此药显著抑制TAC介导AngII的升高(P<0.05),抑制TAC介导的左室前壁,左室后壁增厚以及心肌细胞横截面积(CSA)和纤维化面积增大,同时抑制肥厚相关基因、AT1受体和p-ERK表达上调(P<0.05),；ATG-/-小鼠中,在AngII缺失的情况下,TAC两组间左室前后壁、CSA、纤维化面积以及肥厚相关基因、AT1受体和p-ERK表达无明显差异(P>0.05)。结论：芪苈强心胶囊改善压力超负荷致小鼠心肌肥厚是通过抑制AngII表达来减弱AT1受体激活,非直接抑制压力超负荷机械刺激引起AT1受体的激活。