MiRNA是一类长度约为22nt的非编码小RNA分子。它的初级前体pri-miRNA由基因组编码产生，编码pri-miRNA的基因主要由RNA聚合酶II负责转录。pri-miRNA分子构象含茎环结构，miRNA分子就存在于该结构的5端或3端。在不同物种中, Drosha与其辅助蛋白DGCR8或者Pasha相互作用发挥“分子尺”的作用，判断pri-miRNA的切割位点，生成长度约为70nt的pre-miRNA。Pre-miRNA在Ran-GTP依赖的转运蛋白Exportin-5的作用下,从核内运输到胞质中。随后pre-miRNA在另一种“分子尺” Dicer作用下被剪切成22nt左右，5末端磷酸化、3末端有2nt突起的不完全配对双链RNA。这种双链RNA是由成熟miRNA与miRNA位置互相对应组成的二聚体。最后，在RNA解旋酶作用下生成成熟单链miRNA，成熟miRNA结合到RNA诱导的基因沉默复合物RISC中发挥作用。通过与靶基因3UTR的结合抑制翻译或直接降解mRNA。MiRNA虽然只有20几个碱基，却调控了体内上千基因的表达。它与许多生理病理过程密切相关，参与细胞分裂增殖、分化发育、代谢凋亡等重要的生命过程。虽然从各个方面已经有大量针对miRNA的研究，但是绝大部分miRNA的生物学功能仍然有待阐述。要深入研究一条miRNA，首要也是最关键的步骤是准确找到它发挥功能的靶基因。与植物不同的是，哺乳动物miRNA与靶mRNA之间的序列可以不完全互补，一条miRNA可以作用于多个靶mRNA、多条miRNA也可以作为一个功能簇协同调控某一基因的表达。加之不同细胞、组织中，或者生长、发育的不同状态下，miRNA的表达量存在很大差异，使得确定miRNA的功能性靶基因成为其功能研究的最大瓶颈。在研究miRNA与基因转录后表达调控的过程中，我们发现mRNA在细胞质与细胞核的分布比例(质/核比)与miRNA功能性靶基因之间存在密切关系：针对同一条miRNA的多条靶基因而言, mRNA的质/核比越高越容易成为这条miRNA的功能性靶基因。基于此我们建立了一种基于mRNA质/核比寻找并鉴定miRNA功能性靶基因的寻靶策略，我们在验证寻靶策略的同时还发现：细胞中miRNA的功能性靶标是动态变化的，即不同细胞或同一细胞的不同状态下miRNA靶标可能不一致，真正发挥生物学作用的miRNA靶基因是可变的。因此，如何确定某一细胞在特定状态下的功能性靶标对诠释miRNA的功能具有重要意义。本论文主要研究内容分为两部分：第一部分是miR-138新靶标的确证及生物学功能研究；第二部分miR-30家族靶向GW182影响下游siRNA/miRNA对靶基因调控的相关生物学功能研究。第一部分内容包括：1.通过比对生物信息学预测靶基因和H1299细胞质/核比芯片分析结果，针对miR-138功能性靶标的动态变化展开一系列研究。1)验证质/核比寻靶策略的准确性。首先将H1299细胞基因质/核比芯片结果中质/核比大于1的基因挑选出来，然后将miRanda、TargetScan和PicTar等三个生物信息学数据库中共同预测出的miR-138的靶基因挑选出来，将以上两部分集合取交集，结果得到54个预测靶基因。经体外转染miR-138mimics，利用real-time PCR检测预测靶基因mRNA表达水平，87%的基因被显著下调。这说明根据质/核比筛选出的miR-138靶基因具有比较高的准确度。2)验证miRNA功能性靶基因在不同细胞状态下的动态变化情况。在瞬时转染miR-138的H1299细胞系和稳定过表达miR-138的H1299细胞系里比较miR-138功能性靶基因的变化，结果发现有8个预测靶基因发生了动态变化。将稳定过表达miR-138的H1299细胞株饥饿培养，比较饥饿过程里miR-138功能性靶基因的变化情况。结果发现，在饥饿前后两个不同的细胞状态下，有16个基因mRNA表达水平发生了改变。这说明miR-138的靶基因在H1299不同的细胞状态下会发生动态变化。3)验证不同细胞状态下miRNA功能性靶基因的动态变化与mRNA质/核比的关系。比较瞬时转染与稳定过表达miR-138靶基因的变化情况发现，变化趋势显著不一致的8个基因中，7个靶基因的质/核比发生了明显的变化，呈现mRNA质/核比越高越被下调的趋势。比较稳定过表达miR-138的H1299细胞株在饥饿过程中发生动态变化的miR-138功能性靶基因的质/核比发现，16个发生动态变化的靶基因中，14个靶基因的质/核比发生了明显的变化，呈现mRNA质/核比越高越被下调的趋势。综上所述，我们初步可以判断，在两种细胞之间，或者同一种细胞的不同状态下，miRNA功能性靶标的动态变化与基因的质/核比密切相关，质/核比高状态下的靶基因更易被下调。2. miR-138的功能研究。在上述根据质/核比预测出的靶基因中，我们选择Arognaute4(AGO4)作为miR-138的功能性靶基因展开进一步研究。1) miR-138靶向AGO4的验证。生物信息学数据库TargetScan6.1及H1299mRNA质/核比芯片结果均预测出AGO4为miR-138的功能性靶基因。通过萤光素酶报告基因实验证实miR-138能够直接靶向AGO4mRNA3UTR上的靶位点。向HeLa细胞中转染miR-138mimics能够下调AGO4mRNA水平和蛋白水平的表达量。以上结果表明，miR-138能够靶向AGO4，AGO4是miR-138的靶基因。2) AGO4-TRIM21-HSPA5相互作用的验证。AGO4是真核翻译起始因子蛋白家族成员，哺乳动物体内暂未见明确功能报道。通过蛋白-蛋白相互作用数据库SABiosciencesGene Network CentralTM预测发现，AGO4有可能与泛素化E3连接酶TRIM21共表达，并负调控热休克蛋白HSPA5。据此我们推测AGO4可能作为TRIM21和HSPA5之间的桥梁蛋白，调控TRIM21对HSPA5的降解。HSPA5定位于细胞内质网上，是一个钙离子结合蛋白，参与众多的细胞生理过程。它可以作为分子伴侣参与新生蛋白质的折叠和跨膜转运；它也是内质网上的一种应激蛋白，在低糖、低氧、低Ca2+等应激状态下大量表达以维持内质网的稳定，保护细胞对抗生理变化损伤。近年来研究表明HSPA5在某些肿瘤细胞中高表达,对于肿瘤细胞抗化疗药物的性质及抗原表达有重要意义。具体实验方案如下：i.验证TRIM21-AGO4-HSPA5相互作用。Co-IP实验证实TRIM21-AGO4-HSPA5两两存在相互作用。ii.验证上调AGO4对HSPA5表达的影响。在H1299细胞中转染AGO4真核表达载体和miR-138inhibitor上调AGO4后，利用荧光定量PCR检测HSPA5mRNA的表达水平，HSPA5并无明显变化；经Western Blot检测HSPA5的蛋白表达水平发现，HSPA5表达被下调，这提示，AGO4对HSPA5的调控并不发生在转录水平，而是通过某种蛋白-蛋白相互作用促进后者表达下调。iii.验证下调AGO4后对HSPA5表达的影响。在H1299细胞中转染AGO4siRNA和miR-138mimics下调AGO4表达后，利用荧光定量PCR检测HSPA5mRNA的表达水平，HSPA5并无明显改变；经Western Blot检测HSPA5蛋白水平发现，HSPA5的表达量有所升高。继续提示我们AGO4通过某种蛋白-蛋白相互作用负调控HSPA5的表达。iv.验证下调TRIM21对HSPA5表达的影响。在H1299细胞中用siRNA沉默TRIM21后，利用荧光定量PCR检测HSPA5mRNA的表达水平，HSPA5并无明显变化；经过Western Blot检测蛋白水平的表达情况发现，HSPA5的表达上调，这说明TRIM21与HSPA5表达负相关，但这种调控不影响HSPA5mRNA的转录。v. AGO4有可能作为中间蛋白调控TRIM21-HSPA5的相互作用。在H1299细胞中沉默AGO4后，一方面利用TRIM21抗体钓取HSPA5，另一方面利用HSPA5抗体钓取TRIM21，结果显示：沉默AGO4后TRIM21抗体钓取到的HSPA5蛋白量较NC实验组钓取量减少；沉默AGO4后HSPA5抗体钓取到的TRIM21蛋白量较NC实验组钓取量减少。这些结果说明：AGO4有可能在TRIM21负调控HSPA5的过程里起中间蛋白的作用。vi. miR-138通过靶向AGO4促进细胞凋亡。向H1299细胞中转染miR-138inhibitor、AGO4过表达载体、HSPA5siRNA、NC后，无血清饥饿培养，利用流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示，转染miR-138inhibitor、AGO4过表达载体、HSPA5siRNA的实验组较NC实验组出现明显的促凋亡现象。这说明miR-138通过靶向AGO4的作用能够负调控HSPA5的表达进而促进肿瘤细胞进入凋亡程序。综上所述，我们预测并鉴定AGO4是miR-138的功能性靶基因， AGO4有可能作为一种中间蛋白调控TRIM21对HSPA5的降解，这是AGO4的一个新功能。miR-138通过靶向AGO4的作用能够负调控HSPA5，进而表现为H1299细胞促凋亡现象。本论文第二部分miR-30家族靶向GW182的生物学功能研究则着眼GW182蛋白，并希望通过miR-30家族靶向GW182影响其他miRNA/siRNA对靶基因的调控作用，以揭示miR-30家族调控miRNA/siRNA发挥RNA干扰作用的新功能。主要研究内容包括：1. miR-30家族靶向GW182的预测及验证。根据生物信息学数据库TargetScan6.1预测，GW182为miR-30家族的靶基因。通过萤光素酶报告基因实验证实miR-30家族能够直接靶向GW182mRNA3UTR上的4个靶位点。向HeLa细胞中转染miR-30mimics能够降低GW182mRNA水平和蛋白水平的表达量。以上结果表明，miR-30家族能够靶向GW182，GW182是miR-30家族的靶基因。2. miR-30家族通过靶向GW182抑制miRNA/siRNA发挥RNAi功能。GW182是P-body的标志性分子，抑制GW182的表达有可能会影响miRNA/siRNA发挥基因沉默效应。分别利用文献报道miR-200b能够直接靶向ZEB1、以及GFP siRNA抑制pEGFP-N2质粒表达验证miR-30家族对GW182生物学功能的调控。结果显示，利用miR-30mimics、GW182siRNA先将细胞内GW182蛋白水平下调，再转染miR-200b，48h后检测发现miR-200b靶向ZEB1效应受到抑制；同样先转染miR-30mimics、GW182siRNA将细胞内GW182蛋白下调后，再转染pEGFP-N2质粒与GFP siRNA后镜下观察，GFP siRNA对pEGFP-N2质粒表达的沉默作用明显减弱。以上结果均说明miR-30a、30b通过靶向GW182能够减弱miRNA/siRNA对靶基因的基因沉默。3. miR-30家族通过靶向GW182抑制miR-138对靶基因的调控功能。在关于miR-138与靶基因mRNA质/核比关系的研究中，我们积累了一定有关miR-138功能性靶基因的数据。我们随机选取EIF4EBP1和EIF4EBP2作为miR-138功能性靶基因进行进一步研究。在H1299细胞中利用miR-30mimics、GW182siRNA将细胞内GW182蛋白水平下调后，再转染miR-138，48h后检测发现miR-138对EIF4EBP1和EIF4EBP2的靶向效应被显著抑制。这说明，抑制GW182能够消减miR-138对靶基因的调控。综上所述，我们分别利用生物信息学预测、双萤光素酶报告载体系统、实时荧光定量PCR、Western Blot等实验手段发现并证明了miR-30家族能够靶向GW182。转染miR-30mimics下调GW182后,影响下游siRNA/miRNA对靶基因表达的调控。这些结果揭示了miR-30家族通过靶向GW182影响siRNA/miRNA作用途径的新功能。通过靶向miRNA/siRNA生物学途径中的关键作用分子而影响miRNA/siRNA自身加工过程或者功能效应的一系列miRNA将会越来越受重视。