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阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是发生于老年人群的一种原发性退行性脑病，大于65岁人群的发病率为5％—10％，其确切病因迄今不明。对其发病机制曾先后提出有B淀粉样蛋白学说、胆碱能学说及基因学说等假说，其中β淀粉样蛋白学说日益受到较多学者的认同。AD患者脑内主要病理表现为弥漫性大脑皮质萎缩，大量神经细胞变性丧失，以基底前脑和海马新皮层胆碱能神经元最严重，神经组织内可见许多老年斑和神经元纤维缠结。 β淀粉样蛋白（amyloid β protein,Aβ）是构成老年斑的主要成分，其中Aβ 25-35是活性片段。Aβ由正常存在于细胞膜上的β、γ分泌酶作用下水解形成，近年来已经证实与AD发病有关的基因突变（APP基因、PS-1基因、PS-2基因以及ApoE基因等），都可导致Aβ的异常沉积，Aβ对体外培养及在体神经细胞有损伤作用，提出其可能通过影响细胞内Ca2+离子的平衡，诱导DNA断裂和脂质过氧化，导致神经纤维缠结，产生神经毒性从而损伤胆碱能神经元功能细胞。因此越来越多的学者都以Aβ作为研究AD的关键内容，希望以此为突破，但有关Aβ诱导神经细胞发生的损伤类型以及具体致病机制仍存在很多争论。 盐酸多奈哌齐是近年来应用于临床的一种新型可逆性胆碱酯酶抑制剂，用于治疗轻中度AD，国内外报道其具有一定疗效。最新研究发现，多奈哌齐药理作用复杂多样，除抑制胆碱酯酶作用外，还可能具有减轻自由基损伤、改善脑血流量、拮抗脑内N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体等作用，但在细胞水平上是否能够减第四军医大学硕士学位论文轻由Ap诱导的细胞凋亡以及相关保护机制，尚不十分清楚。目的: 研究Ap25一35对神经元细胞系一大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（RatPheochromocytoma，PC 12）细胞的神经毒性作用以及多奈呱齐对神经细胞的保护作用及其相关机制。方法: 第一部分通过相差显微镜、HE染色、透射电镜观察不同浓度A p 25一35干预下PC12细胞的形态学及超微结构的变化，MTT法、台盼蓝拒染法绘制生长曲线，TUNEL法检测各组细胞的凋亡指数，LDH试剂盒检测细胞上清液中LDH浓度，从而研究Ap对PC12细胞的损伤效应及损伤类型，确定AD细胞模型的建立方法。 第二部分通过MTT法观察不同时间点多奈呱齐干预后PC12细胞（10“m。珑Ap预处理）的增殖活性，检测各组细胞的LDH浓度，流式细胞仪Annexin一V法和TUNEL法检测各组细胞凋亡情况，免疫细胞化学方法检测凋亡相关蛋白Bd一2、CasPase一3的表达，研究多奈呱齐对Ap损伤的PC12细胞的保护作用及其相关可能机制。结果: 实验的第一部分，观察不同剂量Ap25一35蛋白对PC12细胞的影响以及损伤类型。结果显示:PC12细胞对于A p 25一35造成的损伤呈剂量依赖型，随着Ap的浓度增高（5林mol/L，10协mol几，20林mol几），细胞凋亡指数逐步增加（7.9%，1 5.6%，27.8%），LDH浓度相应升高（2 100士150U几，2700士15oU几，3600士15oU几），细胞增殖活性下降，且差异显著;当A p 20林mo比时，细胞形态学可见凋亡与坏死并存，比率大约为1:2，而A plo卜mol几时，细胞以凋亡为主。 实验的第二部分，观察多奈呱齐对A p 10协mol几损伤PC12细胞的保护作用。我们观察了暴露Ap因素的PC12细胞，在多奈呱齐10林m。比不同干预时间下的凋亡百分率、细胞增殖活性以及LDH第四军医大学硕士学位论文浓度。结果显示:单纯Ap损伤组的Bcl一2表达与正常对照组相比降低（43%），而CasPase一3表达升高（46%）。多奈呱齐干预可明显降低A旦对PC12细胞的损伤，但在不同时间点效果不同。其中多奈呱齐提前12h、提前lh干预可明显降低细胞凋亡（17%，26%）与细胞上清液LDH浓度（1 950士1 50U几，2400士150U几），凋亡相关基因Bel一2表达升高（67%、60%），CasPase一3表达降低（12%，27%），细胞增殖活性增高，各指标与单纯Ap处理组相比，差异显著;而多奈呱齐滞后lh组则各指标与单纯Ap组比无明显差异。结论:1 .Ap对PC12细胞存在剂量依赖性损伤作用，引起的细胞损伤中 凋亡与坏死并存;2.5、10脚。比A胆5一35作用于PC12细胞所产生的损伤以凋亡为 主，20林mo比Ap25一35对神经元的损伤方式是凋亡与坏死并存 的，损伤早期即发生明显的坏死;3.10林mo比Ap25一35作用于pC12细胞24一48h，从生化特性、细 胞活力及形态学改变都出现典型神经毒性特征，可作为较理想 的AD细胞模型;4.多奈呱齐在临床常用浓度（10一smouL）下对Ap诱导的这两种损 伤都有一定的保护作用，可以减轻Ap诱导的PC12细胞凋亡和 坏死，且与干预时间的早晚有密切关系;5.多奈呱齐减少Ap诱导的PclZ细胞的凋亡及损伤，其机制可能 为通过调节凋亡相关蛋白Caspase一3、Bcl一2来实现保护作用， 减少细胞凋亡的发生。